黃家富 周曉東 周山

大孔吸附樹脂純化五味子木脂素的工藝考察

黃家富 周曉東 周山

目的建立五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的高效液相色譜法(HPLC)分析方法, 以此為指標(biāo)成分, 利用大孔樹脂純化五味子醇提液, 篩選純化五味子木脂素的最佳樹脂及純化的最佳工藝。對純化前后HPLC色譜圖進(jìn)行比較, 并測定五味子總木脂素的含量。方法動態(tài)上樣法比較各種樹脂對三種成分的吸附及解吸量來篩選最佳純化樹脂, 通過測定三種成分的上樣量和洗脫量來考察最佳上樣工藝及洗脫工藝, 對比純化前后HPLC色譜圖來研究純化合理性, 利用紫外分光光度法來測定純化后五味子總木脂素的含量。結(jié)果最佳純化樹脂為AB-8, 上樣藥液濃度0.128 g/ml, 流速3 ml/min,徑高比1∶3以上, 95%乙醇洗脫。對比HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn), 純化前后色譜峰并無減少。木脂素含量測定結(jié)果顯示純化后五味子木脂素的含量占固形物60%以上。結(jié)論純化合理且必要, 并且工藝簡單實用,可用于工業(yè)生產(chǎn)。

五味子木脂素；大孔樹脂；純化；高效液相色譜法；紫外分光光度法

五味子醇提物是富含油性成分的大劑量多種極難溶性復(fù)雜成分組成的中藥有效部位群提取物, 存在脂肪油、揮發(fā)油、樹脂等油性無效成分, 這不僅降低了活性成分的含量, 增加了制劑的劑量, 也給后續(xù)的制劑工作增添了許多麻煩［1-3］。五味子木脂素是五味子保肝降酶的主要成分, 所以富集木脂素是本研究面臨的首要問題。本文首先建立了五味子三種木脂素的HPLC分析方法, 選擇五味子醇甲、甲素、乙素為指標(biāo)性成分作為考察純化工藝的指標(biāo)。然后篩選大孔樹脂類型,考察上樣工藝和洗脫工藝。最后對純化前后固形物的HPLC色譜圖進(jìn)行對比研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；AS20500A型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TGL-18C-C型高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；CPA225D型電子分析天平(德國sartorius公司)；Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(江蘇漢邦科技有限公司)；SHB-Ⅲ真空泵(鄭州長城科工有限公司)；UV-1100紅外分光光度計(上海美普達(dá)儀器公司)。

1.2試劑及藥品 北五味子(安徽萬生中藥飲片有限公司)；五味子醇甲(批號：110857-201010, 中國藥品生物制品檢定所)；五味子甲素(批號：110857-201010, 中國藥品生物制品檢定所)；五味子乙素(批號：110765-200710, 中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(分析純, 江蘇漢邦科技有限公司)；乙腈(色譜純, 美國Tedia公司)；磷酸(分析純, 南京化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(娃哈哈集團(tuán))；AB-8型樹脂(河北滄州寶恩有限公司)；D101型樹脂(河北滄州寶恩有限公司)；X-5型樹脂(河北滄州寶恩有限公司)；HPD100型樹脂(河北滄州寶恩有限公司)。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1三種五味子木脂素的HPLC分析方法的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱溫 35℃, 進(jìn)樣量 10 μl, 體積流量為1.00 ml/min, 波長檢測λ=254 nm, 流動相為A(乙腈)-B(水), 梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1提取液的制備 取干燥的五味子適量, 用8倍藥材量30%乙醇浸泡過夜, 濾過, 濾液棄去, 生藥殘渣干燥,粉碎成粗粉, 干燥, 稱重。用75%乙醇回流提取3次, 第1次加入4倍量提取3 h, 第2次2倍量2 h, 第3次3倍量1 h,合并提取液, 放置48 h, 棄去沉淀, 虹吸上清液, 減壓回收乙醇得稠狀物, 再加2倍粗粉量95%乙醇, 搖勻, 靜置24 h, 濾過, 收集濾液即得五味子提取液。將醇提液回收乙醇后, 取3等份, 分別加水稀釋成藥材濃度為0.128、0.064、0.032 g/ml的藥液, 備用。

2.1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素適量, 置于25 ml的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度, 即得含五味子醇甲281.6 μg/ml、五味子甲素264.0 μg/ml、五味子乙素493.6 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 備用。

2.1.2.3供試品的制備 取上述提取液適量, 加倍量甲醇,搖勻, 14000 rpm離心10 min, 取上清液微孔濾膜(0.45 μm)濾過, 備用。

2.1.3系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液按上述色譜條件注入色譜儀, 結(jié)果色譜圖見圖1和圖2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取2.1.2.2項下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 ml , 置10 ml 量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度, 搖勻。以此法等比例配制后續(xù)溶液。分別吸取各濃度溶液10 μl, 按2.1.1色譜條件, 進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸, 得到三條標(biāo)準(zhǔn)曲線, 結(jié)果見表2, 三種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度 精密吸取同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μl, 按2.1.1色譜條件, 連續(xù)進(jìn)樣6次, 積分三種成分的面積, 分別記錄五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的面積, RSD(n=6)分別為1.05%、1.15%、1.20%。該測定方法的精密度良好。

表2三種成分回歸方程與線性范圍

2.1.6穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液分別于0 、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣 10 μl, 在2.1.1色譜條件下測定各成分的峰面積,計算各成分峰面積的RSD(n=6) , 結(jié)果為五味子醇甲0.46% 、五味子甲素0.44%、五味子乙素0.078%。結(jié)果表明供試品溶液中上述三種成分在室溫條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7重復(fù)性 按2.1.2.3制備方法制備成供試品溶液, 平行6 份。在2.1.1色譜條件下分別進(jìn)樣10 μl測定, 以峰面積代入回歸方程計算三種成分質(zhì)量濃度, 并計算各成分質(zhì)量濃度的RSD(n=6) , 結(jié)果為五味子醇甲0.94%、五味子甲素1.14%、五味子乙素1.68% 。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收 精密吸取已知含量的供試品適量置于10 ml容量瓶中, 再加入含五味子醇甲281.6 μg/ml、五味子甲素264.0 μg/ml、五味子乙素493.6 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 ml, 加甲醇至刻度, 按2.1.2.3方法制備成供試品溶液, 平行 6 份, 即得。精密吸取上述溶液10 μl, 按2.1.1色譜條件進(jìn)樣測定, 計算各成分回收率和RSD, 結(jié)果見表3。

表3三種成分加樣回收率和RSD(n=6)

2.2大孔樹脂的純化工藝考察

2.2.1大孔樹脂的前處理 稱取一定量的大孔樹脂AB-8、D101、X-5、HPD100, 置于適量體積的95%乙醇浸泡24 h (乙醇沒過樹脂即可), 過濾, 置于玻璃層析柱內(nèi), 用95%的乙醇洗滌, 直到洗滌液加水無渾濁為止。再改用蒸餾水洗滌, 至洗滌液沒有醇味, 取出樹脂, 抽濾干, 密封保存于4℃冰箱內(nèi),備用。

2.2.2大孔吸附樹脂的篩選

2.2.2.1取AB-8、X-5、D101、HPD100四種樹脂各5 g于相同的玻璃層析柱中, 取已知濃度的提取液60 ml, 上樣流速1 ml/min, 殘留液定容到50 ml, 再用50 ml的水沖洗柱子,測定殘留液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量(水洗液中未檢測出三種成分)結(jié)果見圖3。

圖3 四種樹脂對三種成分的吸附量

2.2.2.2取上述已吸附有五味子木脂素的樹脂, 用95%的乙醇沖洗, 直到?jīng)_洗液中檢測不到五味子醇甲、甲素、乙素為止, 合并醇洗液, 測定洗脫液中所含醇甲、乙素、甲素的解吸量, 結(jié)果見圖4。四種樹脂對三種成分都能達(dá)到較好的吸附, 對五味子乙素的吸附呈現(xiàn)出較大差異, 以AB-8的吸附最高, 故考慮選擇AB-8作為純化木脂素的樹脂。

圖4 四種樹脂對三種成分的吸附量

2.2.3上樣工藝考察

2.2.3.1上樣濃度考察 取AB-8樹脂5 g 3份, 分別置于相同的層析柱中, 再取濃度分別為0.128、0.064、0.032 g/ml的藥液, 以1 ml/min的流速上樣, 每5 ml收集流出液, 檢測三種成分, 直到檢測出三種成分為止, 記錄上樣液體積, 計算三種成分的上樣量, 結(jié)果見圖5。三種上樣濃度之間沒有較大的差異, 考慮到上樣時間及未來工業(yè)生產(chǎn), 選擇0.128 g/ml為最佳上樣濃度, 開展后續(xù)研究。

圖5 吸附濃度考察結(jié)果圖

2.2.3.2上樣流速考察 取AB-8樹脂5 g 3份, 分別置于相同的層析柱中, 取濃度為0.128 g/ml的藥液60 ml, 分別以1、2、3 ml/min的流速上樣, 收集殘留液, 50 ml的水沖洗柱子, 檢測殘留液與水洗液中三者成分的量, 三種成分的上樣量結(jié)果見圖6。上樣流速之間沒有較大差別, 考慮到上樣時間,選取3 ml/min作為最終上樣流速。

圖6 吸附流速考察結(jié)果

2.2.3.3徑高比考察 取AB-8樹脂5 g 3份, 分別置于不同粗細(xì)的層析柱中, 形成徑高比為1∶9、1∶3.5、1∶2的層析柱, 取0.128 g/ml的藥液60 ml, 以3 ml/min的流速上樣, 收集殘留液, 50 ml水沖洗柱子, 檢測殘留液和水洗液, 三種成分的上樣量結(jié)果見圖7。徑高比為1∶9和1∶3.5時差異較小,但當(dāng)徑高比為1∶2時, 柱子的吸附量減少。故選擇1∶9或1∶3.5最為最佳徑高比。

圖7 樹脂徑高比考察結(jié)果圖

2.2.4泄露曲線的繪制 取AB-8樹脂5 g置于層析柱中,徑高比為1∶9, 取0.128 g/ml的藥液適量, 以3 ml/min的流速上樣, 殘留液每20 ml收集1次, 檢測三種成分的含量, 以殘留液體積為橫坐標(biāo), 以殘留液中三種成分的質(zhì)量濃度與上樣藥液中質(zhì)量濃度的百分比為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線, 結(jié)果見圖8。

圖8 泄露曲線

2.2.5洗脫工藝考察

2.2.5.1洗脫濃度考察 取AB-8樹脂5 g置于層析柱中,徑高比為1∶9, 取0.128 g/ml的藥液40 ml, 以3 ml/min的流速上樣, 收集殘留液, 50 ml水洗柱, 分別用95%、80%、60%的乙醇適量, 流速為1 ml/min洗脫, 每20 ml收集1次洗脫液,檢測三種成分的含量, 直到檢測不到為止, 合并洗脫液, 檢測三種成分的總量, 并各取50 ml洗脫液蒸干, 測定固形物的量,再用10 ml甲醇溶解固形物, 并測定固形物中三種成分含量,結(jié)果見圖9。洗脫液所用乙醇濃度之間有差異, 選取95%的醇濃度為最佳。

圖9 洗脫醇濃度考察結(jié)果圖

2.2.5.2脫流速考察 取AB-8樹脂5 g 3份置于相同的層析柱中, 徑高比為1∶9, 取0.128 g/ml的藥液40 ml, 以3 ml/ min的流速上樣, 收集殘留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇適量, 流速分別為1、2、3 ml/min洗脫, 每20 ml收集1次洗脫液,檢測三種成分的含量, 直到檢測不到為止, 合并洗脫液, 檢測三種成分的總量, 并各取50 ml洗脫液蒸干, 測定固形物的量, 再用10 ml甲醇溶解固形物, 并測定固形物中三種成分含量, 結(jié)果見圖10。洗脫流速以1 ml/min為最佳, 但三者差異較小, 考慮到洗脫時間, 選擇3 ml/min。

2.2.6洗脫曲線的繪制 取AB-8樹脂5 g置于層析柱中,徑高比為1∶9, 取0.128 g/ml的藥液40 ml, 以3 ml/min的流速上樣, 收集殘留液, 50 ml水洗柱, 用95%乙醇適量, 流速分別為3 ml/min洗脫, 每20 ml收集1次洗脫液, 檢測三種成分的含量, 直到檢測不到為止, 以洗脫液體積為橫坐標(biāo), 三種成分的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線, 結(jié)果見圖11。95%的乙醇洗脫液洗脫至200 ml時能將三種成分完全洗脫。

圖10 洗脫流速考察結(jié)果圖

圖11 洗脫曲線

2.2.7大孔吸附樹脂純化工藝的驗證 按照上述實驗結(jié)果,最終確定最佳純化工藝為：以AB-8樹脂, 上樣液體積與樹脂用量的比例為40 ml∶5 g, 上樣濃度為0.128 mg/ml, 流速為3 ml/min, 徑高比為1∶3以上；洗脫乙醇濃度為95%, 洗脫流速為3 ml/min。按照上述上樣工藝和洗脫工藝平行3份, 驗證所選工藝。結(jié)果見圖12。工藝平行性較好, 能得到較好的驗證。

圖12 工藝驗證結(jié)果

2.3提取液純化前后HPLC色譜圖的對比研究 取20 ml提取液和相對提取液的過柱濾液置于蒸發(fā)皿中蒸干, 測定固形物的含量, 再取20 ml的甲醇溶解, 取適量按2.1.1的色譜條件進(jìn)樣, 得到色譜圖13。過柱前后HPLC的色譜峰沒有增減,所選6種木脂素的轉(zhuǎn)移率都能達(dá)到75%以上, 在固形物中的含量由99.58 mg/g上升到299.11 mg/g, 占固形物含量的30%。固形物中醇甲、甲素、乙素轉(zhuǎn)移率為80%, 固形物中乙素含量為80 mg/g, 固形物得率：4.8 g/100 g藥材。以上數(shù)據(jù)顯示選用AB-8大孔吸附樹脂純化五味子提取液合理。

圖13 過柱前后HPLC色譜圖比較

2.4大孔樹脂純化固形物中總木脂素的含量測定

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用紫外分光光度法測定, 準(zhǔn)確稱取適量五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品于10 ml容量瓶中, 用甲醇定容,取0.1 ml甲醇作為空白樣, 依次取0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ml五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液, 揮去甲醇, 再分別精密加入5%變色酸澄清水溶液0.5 ml、硫酸1.5 ml、水1 ml搖勻, 置沸水浴中加熱30 min后, 迅速冷卻, 以上述甲醇管為空白, 分別在488 nm波長處測定吸光度, 計算含量, 以五味子乙素含量為橫坐標(biāo)(X), 以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得回歸方程Y=12.51X-0.100, r2=0.988。

2.4.2木脂素含量測定 取適量純化液3等份分別置于蒸發(fā)皿中蒸干, 用甲醇溶解, 置于容量瓶中, 再加甲醇定容到一定量, 精密吸取適量置于EP管中, 揮干甲醇, 按2.4.1試劑的加入方法和測定方法, 測定固形物中總木脂素的含量。結(jié)果見表4。

表4固形物中木脂素含量測定

3 討論

3.1本文選取三種木脂素作為大孔樹脂純化五味子木脂素的純化工藝指標(biāo), 是因為首先這三種成分的極性在木脂素中位于高中低的位置, 能最大程度的代表木脂素成分的富集,再者, 這三種成分在木脂素中含量大, 在臨床上的療效更為廣泛確切, 沒有選擇總木脂素作為指標(biāo), 因為顯色反應(yīng)條件不穩(wěn)定, 誤差大, 紅外測定精密度差［4-9］。

3.2AB-8大孔吸附樹脂最適用于從極性溶劑中吸附弱極性物質(zhì)。五味子中的木脂素成分大多具有聯(lián)苯環(huán)辛二烯母核,是一類低極性小分子化合物［10］。用AB-8來純化能達(dá)到很好的分離效果。

3.3由于木脂素為難溶性有效部位, 濃度過大會形成混懸液, 導(dǎo)致上樣量難以控制, 堵塞大孔樹脂［11-13］。所以在上樣濃度的考察時, 結(jié)合預(yù)實驗選擇上述的三種濃度。上樣流速間沒有明顯的差異, 考慮到上樣時間和工業(yè)生產(chǎn), 選擇最大的流速。

3.4通過對比純化前后的色譜圖, 作者發(fā)現(xiàn)6種木脂素的轉(zhuǎn)移率都在75%以上, 固形物量減少兩倍, 總木脂素的量占固形物的64%。結(jié)果表明大孔樹脂純化能達(dá)到精致富集木脂素類成分的目的?？捎糜谖逦蹲铀幉娜胨幍那疤幚怼?/p>

本文建立了同時測定固形物中6種木脂素的方法, 為五味子固形物質(zhì)量控制提供依據(jù)。選擇五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素作為大孔樹脂純化的指標(biāo), 最后確定了純化工藝為：AB-8樹脂純化, 上樣藥液濃度0.128 g/ml, 流速3 ml/min, 徑高比1∶3以上, 95%乙醇洗脫。對純化前后的固形物進(jìn)行含量測定和分析, 確定AB-8純化五味子木脂素的科學(xué)合理性。

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Process investigation on purification of schisandra chinensis lignans by macroporous resin

HUANG Jiafu, ZHOU Xiao-dong, ZHOU Shan.
Department of Drug and Equipment, The People’s Liberation Army 102nd Hospital, Changzhou 213003, China

ObjectiveTo establish a method for determining concentrations of schisandrol A, deoxyschisandrin and schisandrin B from Schisandra chinensis by high performance liquid chromatography (HPLC).To use macroporous resin for purification of schisandrol A, and to filtrate the superior resin for the purification of total lignans from schisandra chinensis and the optimum purification process.At last, to compare the results of HPLC chromatograms before and after purification, and to determinate the content of total lignans from schisandra chinensis.MethodBased on results of adsorption and desorption of different resin for the three ingredients using dynamic injection method, the best purified resin was selected.Injection and elution volume of the three components above-mentioned were measured to determine the best injection and elution process.The reasonableness of the purification was examined according to the results of the HPLC chromatograms before and after the purification process.The content of total lignans from schisandra chinensis after purification was measured by UV spectrophotometry.ResultsThe best purifying- resin was AB-8; the concentration of injection was 0.128 g/ml; the flow rate was 3ml/min; the diameter ratio was more than 1:3 and the ethanol elution was 95%.According to the HPLC chromatograms, chromatographic peak was not reduced after the purification process.The content of total lignans from schisandra chinensis accounted for more than 60% of the total solids after purification.ConclusionThe purification process is reasonable, simple, practical and suitable for industrial production.

Schisandra chinensis lignans; Macroporous resin; Purification; High performance liquid chromatography; UV spectrophotometry

2014-07-29］

213003 解放軍第102醫(yī)院藥械科(黃家富)；南京軍區(qū)南京總醫(yī)院湯山分院藥械科(周曉東)；正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司南京研發(fā)中心(周山)