楊俊換，郭華，歐陽晶

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

據(jù)國家糧油信息中心統(tǒng)計(jì)，1990年中國油茶籽產(chǎn)量為52.3 萬t，2012年為109.2 萬t，累積增長了108.8%，平均年增長5.4%[1]。油茶籽殼的主要成分為木質(zhì)素、纖維素與半纖維素。目前國內(nèi)對油茶籽殼的利用仍處于研究階段，主要用來制備活性炭、木糖醇和糠醛等產(chǎn)品，利用率較低。利用康寧木霉發(fā)酵油茶籽殼產(chǎn)纖維素酶，不僅可以緩解資源浪費(fèi)與環(huán)境破壞問題，還可以增加油茶籽殼利用的附加值，生產(chǎn)的纖維素酶可以用于食品、農(nóng)業(yè)和飼料等行業(yè)。利用響應(yīng)面法[2–4]優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵玉米秸稈粉，濾紙酶活力最高達(dá)59.432 U/g[5]。利用響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件后，纖維素酶的酶活力提高了34.4% 。筆者研究利用康寧木霉發(fā)酵油茶籽殼產(chǎn)纖維素的優(yōu)化條件，旨在為油茶籽殼的利用與纖維素酶的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

康寧木霉由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。油茶籽殼由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)康奕達(dá)油茶產(chǎn)品研究中心提供。

PDA 培養(yǎng)基的配制：將馬鈴薯汁200 g、葡萄糖20 g、瓊脂25 g、水1 L 充分混合，121 ℃滅菌20 min。

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配制：將油茶籽殼2.5 g、麩皮0.5 g、發(fā)酵營養(yǎng)液20 mL 置于100 mL 錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。其中，發(fā)酵營養(yǎng)液為(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、FeSO40.05 g、MnSO40.016 g、ZnSO40.014 g、CoCl20.02 g、水1 L的混合溶液。

1.2 方 法

1.2.1 油茶籽殼預(yù)處理

油茶籽殼原料(簡稱UTM)：油茶籽殼經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎，過孔徑0.45 cm 篩。

酸處理油茶籽殼(簡稱ACM)：將UTM 用0.5%硫酸溶液浸泡1 d，用清水洗滌至中性，于70 ℃烘干，備用。

醇處理油茶籽殼(ALM)：將UTM 用65%的乙醇溶液浸泡2 h，用清水洗滌3 次，于70 ℃烘干備用。

堿處理油茶籽殼(ETM)：將UTM 用2%的氫氧化鉀溶液浸泡1 d，用清水洗滌至中性，于70 ℃烘干，備用。

1.2.2 康寧木霉產(chǎn)酶培養(yǎng)

將康寧木霉接種到PDA 斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d 后，用10 mL 無菌生理鹽水在無菌條件下洗出其孢子。將孢子移入試管，混勻，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板鏡檢，待孢子濃度為107個(gè)/mL 時(shí)按5% 接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于150 r/min、28 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d。

1.2.3 粗酶液制備

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基接種發(fā)酵5 d 后，于50 ℃水浴恒溫振蕩器中振搖1 h。取適量的發(fā)酵液于4 000 r/min離心15 min。離心后的上清液即為粗酶液。將粗酶液用pH 4.8 的枸櫞酸–枸櫞酸鈉緩沖溶液稀釋到一定的倍數(shù)后，吸取0.50 mL 測定酶活力。

1.2.4 羧甲基纖維素酶酶活力的測定

1) 用3,5–二硝基水楊酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2) 羧甲基纖維素酶(Carboxymethyl cellulase enzyme,CMCase)的酶活力測定：于干凈試管中分別加入1%的CMCase (0.1 mol/L 枸櫞酸–枸櫞酸鈉，緩沖液，pH 4.8) 1.5 mL 和0.50 mL 酶液，50 ℃準(zhǔn)確保溫30 min，沸水浴滅活，取出加入3.0 mL DNS 試劑，煮沸7 min，冷卻后加蒸餾水10 mL，搖勻靜置10 min，于波長540 nm 處測定光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量，折算成酶活力[7]。以滅活的酶液作為對照。在上述條件下， 1 min 內(nèi)由水解底物生成1 μg 葡萄糖所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位(U)[8]。每組數(shù)據(jù)均平行測定3 次。

1.3 單因素試驗(yàn)

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以發(fā)酵液中CMCase 的酶活力為指標(biāo)，針對培養(yǎng)基中的油茶籽殼預(yù)處理方法(UTM、ACM、ALM、ETM)、氮源(0.2%的(NH4)2SO4、0.2%的(NH4)3PO4、尿素、蛋白胨、酵母膏)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)、發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7、8 d)、接種量(5%、10%、15%、20%、25%)、營養(yǎng)液體積(12、18、24、30、36 mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，確定響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平，選取3 個(gè)主要影響因子為自變量，即針對發(fā)酵時(shí)間(A)、初始pH(B)、營養(yǎng)液體積(C)3 個(gè)因素，根據(jù)Box–Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵液中粗酶液CMCase 的酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，以估計(jì)誤差。中心組合試驗(yàn)方案中的因素及水平如表1 所示。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中的因素及水平Table 1 Factors and levels used in the Box-Behnken design

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)前面試驗(yàn)所得到的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行試驗(yàn)，將優(yōu)化試驗(yàn)所得到的CMCase 酶活力與發(fā)酵條件進(jìn)行擬合，以驗(yàn)證模型的可靠性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件Design–Expert 7.1.6 進(jìn)行回歸分析，建立CMCase 活力關(guān)于發(fā)酵條件的回歸模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)(x)，以O(shè)D為縱坐標(biāo)(y)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程y =0.431 3x–0.004 6，R2= 0.999 6。曲線可信度較高，可以應(yīng)用。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 油茶籽殼預(yù)處理方式的選取

由表2 可見，各預(yù)處理方式對CMCase 酶活力的影響較大，堿處理、醇處理、酸處理油茶籽殼的CMCase 酶活力依次減小，未處理油茶籽殼的CMCase 酶活力最低。考慮到堿處理油茶籽殼的成本比較低，而其發(fā)酵產(chǎn)CMCase 的酶活力較高，故選擇堿處理作為油茶籽殼的預(yù)處理方式。

表2 康寧木霉產(chǎn)CMCase 的酶活力單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the single factor experiment for CMCase activity using Trichoderma koningii

2.2.2 適宜氮源的選取

由表2 可見，康寧木霉可以利用多種氮源，氮源種類對CMCase 酶活力有較大影響，硫酸銨、磷酸銨等無機(jī)氮源比有機(jī)氮源發(fā)酵油茶籽殼產(chǎn)CMCase的酶活力高。雖然氮源并不能作為誘導(dǎo)纖維素酶的誘導(dǎo)物，但對菌體的迅速增長有很重要的作用，對產(chǎn)酶影響較大。利用無機(jī)氮源發(fā)酵油茶籽殼的成本較低，酶活力較高，故選擇硫酸銨作為發(fā)酵氮源。

2.2.3 適宜初始pH 的選取

由表2 可見，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 為4.0～6.0，隨pH 升高，發(fā)酵CMCase 的酶活力明顯增加，pH為6.0 時(shí)達(dá)到最高，隨后隨pH 升高，酶活力呈下降趨勢。產(chǎn)CMCase 發(fā)酵培養(yǎng)基適宜的起始pH 為6.0，自然pH。

2.2.4 適宜發(fā)酵時(shí)間的選取

由表2 可見，發(fā)酵時(shí)間對CMCase 的酶活力影響較大，發(fā)酵時(shí)間為1～5 d 時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)間的延長CMCase 的酶活力明顯增加，在發(fā)酵5 d 時(shí)達(dá)到最高，CMCase 的酶活力為142.87 U/mL；隨后隨發(fā)酵時(shí)間的增加，CMCase 的酶活力下降，故認(rèn)為5 d為適宜發(fā)酵時(shí)間。

2.2.5 適宜接種量的選取

由表2 可見，隨著接種量的增加，CMCase 的酶活力呈降低趨勢。發(fā)酵培養(yǎng)基中含氧量與營養(yǎng)物質(zhì)是一定的，接種量越多，則孢子生長競爭越大，導(dǎo)致CMCase 的酶活力降低；接種量越小，則導(dǎo)致進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間延長，發(fā)酵周期長，故認(rèn)為適宜接種量為5%。

2.2.6 適宜裝樣量的選取

由表2 可見，隨著營養(yǎng)液體積的增加，CMCase的酶活力先增加后減小。營養(yǎng)液體積為12～24 mL時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)的增加促進(jìn)康寧木霉的生長，酶活力增加，在營養(yǎng)液體積為24 mL 時(shí)，CMCase 的酶活力達(dá)143.70 U/mL；營養(yǎng)液體積進(jìn)一步增加，接觸氧氣的液面減少，發(fā)酵受到抑制，CMCase 的酶活力降低，故認(rèn)為適宜營養(yǎng)液體積為24 mL。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立及分析結(jié)果

對表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得方程y = 11.1 x1– 5.505 x2–22.477 5 x3–18.222 5 x1x2+21.677 5 x1x3+ 16.907 5 x2x3–36.834 3 x12–29.524 3x22–30.949 3x32。式中：y 為CMCase 的酶活力(U/mL)，x1為發(fā)酵時(shí)間，x2為初始pH，x3為營養(yǎng)液體積。對上述回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，模型的校正決定系數(shù)為0.997 8，說明此模型能解釋99.78%響應(yīng)值的變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高，試驗(yàn)誤差小。對方程系數(shù)進(jìn)行方差分析，模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)交互影響顯著，各影響因素對CMCase 酶活力的影響不是簡單的線性關(guān)系，其影響從大到小依次為營養(yǎng)液體積、發(fā)酵時(shí)間、初始pH。對該模型進(jìn)行方差分析和對模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，回歸模型極顯著(P＜0.01)，說明建立的模型有意義；模型失擬項(xiàng)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056 9＞0.05)，說明模型擬合度良好，可用此模型和方程來分析和預(yù)測發(fā)酵油茶籽殼產(chǎn)CMCase 的酶活力大小。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及CMCase 酶活力響應(yīng)值Table 3 Scheme of Box-Behnken design and response values of CMCase activity

2.3.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

由響應(yīng)面分析結(jié)果(圖1～3)可見，在營養(yǎng)液體積一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間與初始pH 增加，發(fā)酵液中CMCase 的酶活力先增加后減小；在初始pH 一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間與營養(yǎng)液體積增加，發(fā)酵液中CMCase 的酶活力先增加后減小；在發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，隨著pH 與營養(yǎng)液體積的增加，發(fā)酵液中CMCase的酶活力先增加后減小。利用Design–Expert 7.1.6進(jìn)行優(yōu)化處理，得到使得CMCase 酶活力最大的發(fā)酵條件為培養(yǎng)時(shí)間5.09 d、初始pH 5.77、營養(yǎng)液體積21.63 mL。CMCase 酶活力最大預(yù)測值為179.324 U/mL。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間(A)與初始pH(B)對CMCase 酶活力影響的響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.1 Chart of response surface on the effects of days of fermentation and initial pH values on CMCase activity

圖2 培養(yǎng)時(shí)間(A)與營養(yǎng)液體積(C)對CMCase 酶活力影響的響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.2 Chart of response surface on the effects of days of fermentation and volume of liquid on CMCase activity

圖3 初始pH(B)與營養(yǎng)液體積(C)對CMCase 酶活力影響的響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.3 Chart of response surface on the effects of initial pH value and volume of liquid on CMCase activity

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)得到的結(jié)果，考慮到試驗(yàn)的可操作性，在如下條件下進(jìn)行用油茶籽殼發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的驗(yàn)證試驗(yàn)：原料預(yù)處理采用堿處理法，氮源采用0.2%的(NH4)2SO4，接種量為5%，初始pH 為5.8，營養(yǎng)液體積為22 mL，發(fā)酵時(shí)間為5 d。5 組驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)酵液的平均CMCase 酶活力為179.15 U/mL，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明模型有效、可靠。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)本研究結(jié)果，經(jīng)綜合考慮，認(rèn)為油茶籽殼發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的適宜條件為：油茶籽殼預(yù)處理采用堿處理方法，以0.2%的(NH4)2SO4為氮源，種子液接種量為5%，初始pH 為5.8，營養(yǎng)液體積為22 mL，發(fā)酵時(shí)間為5 d。優(yōu)化條件下CMCase 的酶活力為179.15 U/mL，比單因素試驗(yàn)最高酶活力提高了24.52%。

國內(nèi)外學(xué)者多以里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichoderma viride)和青霉(Penicillium sp.)作為菌株，以酒糟、稻草、玉米秸稈等為碳源生產(chǎn)纖維素酶[9–11]，如王菁莎[10]等利用康寧木霉固態(tài)發(fā)酵稻草粉，濾紙酶活力為172.3 U/mL；武香玉[11]等采用固態(tài)發(fā)酵酒糟的方法生產(chǎn)纖維素酶，其CMCase 的酶活力為7 105.92 U/g。本研究中采用纖維素酶高產(chǎn)菌種康寧木霉發(fā)酵油茶籽殼，產(chǎn)出的纖維素酶的酶活力雖然比利用稻草、酒糟等的低，但其可為油茶籽殼的綜合利用提供參考。目前，中國的纖維素酶工業(yè)仍處于研究、開發(fā)階段，全國僅有少數(shù)幾家工廠在小批量試產(chǎn)，產(chǎn)品供不應(yīng)求，因此，利用油茶籽殼液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶具有廣闊的開發(fā)前景。

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