樊勤學(xué)， 徐江波， 袁 宏， 周文正， 孫俊剛， 趙喜濱， 王 浩， 徐萬龍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科， 烏魯木齊 830001)

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病(Hydatid Disease)，是指由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲(E.oligarthrus)、寡節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthrus Diesing)和福氏棘球絳蟲(E.vogeli Rausch &Bernstein)的幼蟲在人畜之間相互傳染的寄生蟲病，嚴(yán)重危害全球人類的健康。我國包蟲病的發(fā)病率很高[1]，尤其是地處邊疆的新疆[2-3]。骨包蟲在人體各臟器包蟲病的發(fā)病率位居第3位，肝臟和肺臟的包蟲病發(fā)病率則位居第1、2位。臨床上針對骨包蟲的治療仍然以手術(shù)為主，但由于骨松質(zhì)的存在，骨包蟲的復(fù)發(fā)率很高。而由于藥物在骨包蟲囊內(nèi)的濃度極低，所以藥物治療效果差。采用三維適形調(diào)強(qiáng)放療(IMRT)對骨包蟲實施根治性、無侵入性放療，是一種較為理想的治療方法，但迄今IMRT對骨包蟲的殺滅效果、可能的機(jī)制人們?nèi)灾跎?，目前尚無成熟的報道。為觀察IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的殺滅效果，本研究通過對骨包蟲病大鼠骨棘球蚴病灶區(qū)實施IMRT，檢測骨棘球蚴包囊中細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)情況，以期為臨床上將IMRT用于骨包蟲的治療提供實驗室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物選用中國武警總醫(yī)院實驗動物實驗室提供的雙側(cè)股骨繼發(fā)性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。將骨包蟲大鼠先行X線及CT檢查，均提示股骨繼發(fā)性棘球蚴接種成功。骨棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，俯臥位擺置于自制的放療體膜內(nèi)，并穩(wěn)定固定。采用飛利浦Mx8000多層螺旋CT掃描機(jī)對左側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)進(jìn)行掃描，掃描密度為1 mm/層。將收集的數(shù)據(jù)上傳到Somavison系統(tǒng)內(nèi)，進(jìn)行信息重建，并將周圍的血管、肌腱、神經(jīng)、皮膚勾畫為需要保護(hù)的器官。勾畫完放療區(qū)域后，利用三維適形調(diào)強(qiáng)放療儀的計算機(jī)計算系統(tǒng)對骨包蟲區(qū)域的放射劑量及劑量分布均勻程度按照放療計劃進(jìn)行分析和計算。經(jīng)專業(yè)放射物理師在14 d內(nèi)，對50只大鼠左側(cè)股骨骨棘球蚴病區(qū)分別給予40 Gy劑量的IMRT治療，右側(cè)股骨只給予假照射作為陰性對照。

1.2取材將經(jīng)IMRT放射治療后的棘球蚴病大鼠吸入麻醉后，空氣栓塞活殺處死，在顯微鏡下取出雙側(cè)股骨骨髓腔內(nèi)的骨包蟲的包囊，經(jīng)甲醛、戊二醛浸泡后低溫保存。

1.3電鏡檢測將標(biāo)本經(jīng)戊二醛、鋨酸處理后的包蟲組織進(jìn)行浸泡后用緩沖液進(jìn)行反復(fù)沖洗，采用階梯濃度的醫(yī)學(xué)酒精進(jìn)行反復(fù)脫水處理，再次用緩沖液進(jìn)行反復(fù)沖洗，浸泡于丙酮中進(jìn)行低溫保存。標(biāo)本采用環(huán)氧樹脂、固化劑等進(jìn)行浸泡后包埋并烘干，對組織塊進(jìn)行休整并切片后鋪于金屬銅網(wǎng)表面，依次進(jìn)行枸櫞酸鉛、醋酸鈾的染色。通過電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。

1.4RT-PCR檢測Caspase-3基因上下游引物序列為F： 5′AGATCACAGCAAAAGGAGCAGT3′；R：5′TCAAGCTTGTCGGCATACTGT3′。將骨棘球蚴病的組織采用液氮進(jìn)行研磨，裝入含有Trizol的離心管中，將其充分混勻、裂解、沉淀并澄明，加入氯仿后混勻，加入異丙醇并混勻，離心后棄上清，加入乙醇后沉淀，棄上清后將沉淀進(jìn)行保留、干燥。加入DEPC后溶解，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析測定。將骨棘球蚴的Caspase-3的RNA從-80℃冰箱取出，解凍后組配逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系。在PCR儀上加少量冰進(jìn)行冷卻，加入Frist-Strand Buffer、RNasin、TIANScript M-MLV、Total Volume，將以上體系進(jìn)行配比后離心，在PCR儀上加溫并終止反應(yīng)，冷卻后進(jìn)行稀釋。配制PCR反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)ABI7500熒光定量PCR循環(huán)條件。對結(jié)果進(jìn)行分析：擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以 GAPDH 為內(nèi)參照基因，得到目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1透射電鏡觀察IMRT對骨包蟲的殺滅效果透射電鏡結(jié)果提示，未接受放療鼠骨棘球蚴包囊細(xì)胞正常形態(tài)存在，細(xì)胞膜未出現(xiàn)破裂，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)完整，細(xì)胞核居中，無固縮(圖1)。經(jīng)放射治療后的骨包蟲的囊壁可見大量的變性壞死，生發(fā)細(xì)胞大量減少，細(xì)胞板層結(jié)構(gòu)受損、出現(xiàn)層列，間隙間可見空泡樣改變，甚至一些細(xì)胞直接出現(xiàn)崩裂樣狀態(tài)，無法分辨正常的細(xì)胞形態(tài)。所有正常細(xì)胞形態(tài)消失，細(xì)胞胞質(zhì)排列疏散，線粒體變粗腫脹，線粒體內(nèi)嵴擁擠、斷開，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒樣改變、疏松，細(xì)胞核崩裂、固縮，可見凋亡小體(圖2)。

圖1 未接受放療骨棘球蚴包囊細(xì)胞(電鏡8 000倍)

圖2IMRT放療后骨棘球蚴包囊細(xì)胞(電鏡8000倍)

2.2RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)情況RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IMRT作用后的左側(cè)股骨棘球蚴包囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3大量表達(dá)，Caspase-3 mRNA 的RQ值為(67.39±17.35)。但未接受IMRT治療的右側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)極少量，Caspase-3 mRNA 的RQ值為(1.43±0.53)，左側(cè)與右側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.984，P<0.05)。

3 討論

自1996年美國紐約的Memorial Sloan-Kettering Cancer Center首先發(fā)表文章闡述適形調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)至今，IMRT已有15 a的發(fā)展歷史。IMRT是通過計算機(jī)來控制射線的方向，可將精確的、劑量高的射線集中在醫(yī)者所關(guān)心的病變組織區(qū)域，而周圍組織很少受到射線的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學(xué)者的推崇。根據(jù)IMRT對腫瘤細(xì)胞有很高的殺滅作用，筆者認(rèn)為IMRT對骨包蟲的細(xì)胞也應(yīng)該有很好的殺滅作用。故本研究通過對骨包蟲病實施IMRT，通過電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明經(jīng)放射后的骨包蟲的囊壁可見大量的變性壞死，所有正常細(xì)胞形態(tài)消失，細(xì)胞胞質(zhì)排列疏散，線粒體變粗腫脹，線粒體內(nèi)嵴擁擠、斷開，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒樣改變、疏松，細(xì)胞核崩裂、固縮，可見凋亡小體，以上顯微鏡下所觀察到的現(xiàn)象均為放射性骨壞死典型的病理改變，所以本研究認(rèn)為IMRT可以集中射線，局部高能殺滅骨包蟲，而且放射線可徹底清除深藏于松質(zhì)骨、骨小梁中間的骨包蟲頭節(jié)，降低骨包蟲殘留率、復(fù)發(fā)率。本研究表明，骨棘球蚴包囊細(xì)胞對IMRT的射線敏感，IMRT對骨棘球蚴包囊細(xì)胞有較明顯的殺傷作用，以上結(jié)果與IMRT臨床上直接應(yīng)用于多數(shù)腫瘤細(xì)胞的實驗結(jié)果相同[4-6]。

本實驗證明了IMRT對殺滅骨棘球蚴病有很好的效果，IMRT可促進(jìn)新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴包囊細(xì)胞的凋亡。IMRT對殺滅骨棘球蚴有2條途徑[4-6]：(1)直接損傷效應(yīng)：指組織細(xì)胞的關(guān)鍵生物大分子直接吸收射線的能量所造成的損傷；(2)間接損傷效應(yīng)：指生物大分子及其周圍的其他分子(主要為水分子)在吸收射線的能量后產(chǎn)生大量的氧自由基，繼而發(fā)揮對關(guān)鍵生物大分子的損傷效應(yīng)。其中DNA是電離輻射作用的主要靶分子之一，電離輻射可導(dǎo)致多種形式的DNA損傷，如堿基變化、脫氧核糖變化、DNA鏈斷裂和交聯(lián)(DNA鏈交聯(lián)和DNA-蛋白交聯(lián))。而DNA鏈斷裂是輻射損傷的主要形式，其中DNA單鏈斷裂與輻射劑量呈線性關(guān)系，但DNA雙鏈斷裂可高于射線的直接電離作用；而且射線還可干預(yù)堿基損傷以及單鏈DNA斷裂之后的損傷修復(fù)過程，如果是雙鏈DNA斷裂，則可導(dǎo)致細(xì)胞致死性的損傷。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，IMRT作用后的左側(cè)股骨棘球蚴包囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3大量表達(dá)，但未接受IMRT治療的右側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)棘球蚴包囊細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá)極少量。凋亡蛋白酶的激活是凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，Caspase家族活化對放射后骨棘球蚴細(xì)胞的凋亡起著至關(guān)重要的作用。Caspase家族本質(zhì)上是天冬氨酸蛋白酶，因此在正常的細(xì)胞體內(nèi)都以無活性的酶原狀態(tài)存在。但是當(dāng)細(xì)胞受損傷而產(chǎn)生凋亡時，首先表現(xiàn)為Caspase 活化，其余的 Caspase依次關(guān)聯(lián)為級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase的成員有很多，其中與凋亡的關(guān)系最為密切的因子是Caspase-3，其作用于凋亡的中期，而且其在細(xì)胞凋亡效應(yīng)階段起核心作用。

本研究針對大鼠股骨骨棘球蚴區(qū)域給予40 Gy劑量的IMRT治療，從照射后棘球蚴包囊細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、凋亡因子的表達(dá)均提示：IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴有很好的殺滅作用。提示通過IMRT合理的放療方案的實施，臨床可達(dá)到對骨棘球蚴的創(chuàng)傷小、療程短、根治性的治療。本研究初步證實IMRT可以直接導(dǎo)致新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴包囊細(xì)胞的凋亡，可以通過激活Caspase-3誘導(dǎo)生發(fā)細(xì)胞凋亡，但是IMRT如何讓激活 Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的上游事件還不清楚，有待進(jìn)一步探索。

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