李鶯，王毅紅，王亮，李嬋君

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，鄭州 450006）

GC-MS法測定豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留

李鶯，王毅紅，王亮，李嬋君

（鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，鄭州 450006）

建立了乙酸乙酯提取、SCX小柱凈化、GC-MS分析、外標法定量的豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法。鹽酸克倫特羅在10.24～512.0 ng／mL的范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)r=0.999 7。在1.92，5.12，12.80 μg／kg添加水平下的回收率為73.0%～84.8%，測定結(jié)果的相對標準偏差為4.3%～8.2%（n=6）。2日間3濃度點的日間平均回收率在77.1%～81.2%之間，相對偏差在1.3%～5.3%之間。該方法簡便、快速，精密度和準確度較好，能滿足日常大批量豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留的檢測要求。

氣相色譜-質(zhì)譜法；鹽酸克倫特羅；豬肉樣品；方法比較

瘦肉精不是飼料，也不屬于飼料添加劑，而是一類叫做β-興奮劑的藥物。在豬的養(yǎng)殖中大劑量使用瘦肉精能顯著提高豬肉瘦肉率。瘦肉精經(jīng)食物鏈被人食用后人體會受到損害，嚴重時會引發(fā)中毒。這種藥物的濫用問題至今依然是全社會普遍關注的食品安全熱點之一。

近年β-興奮劑藥物鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的檢測均有報道［1-3］。萊克多巴胺屬于苯酚型結(jié)構(gòu)，在豬體內(nèi)與葡萄糖甘酸結(jié)合，檢測中需在提取前后用酶水解約12～16 h［4～5］。而克倫特羅屬于苯胺型結(jié)構(gòu)，在豬體內(nèi)以游離態(tài)存在，水解前后結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別［6］。若要實現(xiàn)克倫特羅與萊克多巴胺的同時檢測，需用較長時間進行水解，會增加前處理的時間。另外萊克多巴胺毒性低，在體內(nèi)代謝快速，不易產(chǎn)生嚴重的累積殘留［3］，且現(xiàn)今為止發(fā)生的瘦肉精事件都是由克倫特羅藥物引起中毒的。因此通常情況下，對鹽酸克倫特羅的單獨、快速檢測依然是基層檢測工作者必備的技能。

目前對于動物組織樣品中單獨針對鹽酸克倫特羅的定量檢測，現(xiàn)行的標準有GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006，兩標準推薦的樣品前處理步驟及上機采集離子都不相同，這就給檢測方法的選擇和建立造成了困惑。筆者分別依照兩個標準展開實驗，對兩標準各自推薦的樣品提取方法和凈化方法進行了實驗比較、討論和檢測結(jié)果比對，并且對兩標準中各自推薦的采集離子進行了監(jiān)測選擇，對兩標準進行優(yōu)化、整合，建立了快速、可靠、適合日常檢測工作的GC-MS分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型,日本島津公司；

電子天平：JM-B3002型（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司），XP-204型（梅特勒-托利多公司）；

SCX強陽離子交換小柱、WCX弱陽離子交換小柱：500 mg／3 mL，美國色譜科公司；

針筒式微孔過濾膜：0.45μm，水相，天津市津騰實驗設備有限公司；

甲醇、乙酸乙酯、異丙醇：色譜純，美國J. T. Baker公司；

甲苯：色譜純，天津化學試劑研究所；

碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸二氫鈉、氯化鈉、高氯酸：分析純；

雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）：美國色譜科公司；

鹽酸克倫特羅標準品：純度為98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS 5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦（純度為99.999%），流速為1 mL／min；進樣口溫度：240℃；柱溫：初溫70℃，保持1 min，以18℃／min升至200℃，再以5℃／min升至245℃，以25℃／min升至280℃，保持2 min；進樣體積：1 μL；不分流進樣。

1.2.2 質(zhì)譜條件

EI源；電子能量：70 eV；源溫：200℃；接口溫度：260℃；容積延遲：3.5 min；測定方式：離子監(jiān)測（SIM）；監(jiān)測范圍：11.75～12.75 min；監(jiān)測離子：m／z 86，187，243，262。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取凈化

依照NY／T 468-2006，稱?。?±0.05）g豬肉樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，勻漿提取后離心，收集上層有機相，再向樣品中加入10 mL乙酸乙酯渦旋混合后離心，收集并合并提取液。在收集的提取液中加入5 mL 0.1 mol／L的鹽酸溶液，渦旋混合后離心。吸取下層水相，重復萃取一次，合并萃取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為4.5。

以上樣品液經(jīng)SCX小柱凈化，依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol／L鹽酸活化，萃取液上柱，以5 mL水和5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，再用5 mL 4%的氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，完成對樣品的提取和凈化過程。

1.3.2 衍生化

將1.3.1得到的樣品液，置于60℃水浴中氮氣吹干，加入200 μL甲苯和100 μL BSTFA，迅速加蓋，渦旋30 s后，置于80℃的烘箱中衍生1 h，待冷卻后加入200 μL甲苯，渦旋混勻。進行GC-MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

鹽酸克倫特羅含苯胺取代基，在酸性條件下，以離子態(tài)存在，易溶于水溶液；在堿性條件下，以游離態(tài)存在，易溶于有機溶劑［9］。GB／T 5009.192-2003與NY／T 468-2006兩標準中的提取方法正是代表了這兩種不同的情況。

NY／T 468-2006樣品預處理方法即前述1.3.1步驟，即先在堿性條件下用有機試劑提取，再利用稀酸萃取，同時完成除脂、除蛋白。而GB／T 5009.192-2003是先用酸溶液提取，同時完成去脂、去蛋白，再在堿性環(huán)境下利用有機相振蕩萃取后濃縮。具體過程：將樣品在0.1 mol／L的高氯酸溶液中勻漿，并經(jīng)80℃水浴超聲提取，提取樣液用NaOH溶液調(diào)pH值到9.5后，加鹽并用異丙醇-乙酸乙酯（4∶6）進行振蕩萃取，濃縮有機相后，用磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解殘留物，經(jīng)針筒濾膜過濾待凈化，完成對樣品的提取過程。

試驗發(fā)現(xiàn)，GB／T 5009.192-2003的提取方法在有機試劑振蕩萃取過程中易出現(xiàn)乳化，之所以出現(xiàn)這種情況，應該是有些樣品中蛋白含量較高，經(jīng)高氯酸溶解，輔以超聲、加熱處理后仍有部分蛋白殘留于提取液中，而后在強堿條件下沉淀析出，從而在振蕩萃取過程中發(fā)生了乳化現(xiàn)象。此外，該方法使用的實驗器皿多、試劑品種多且用量大，步驟繁瑣、耗時長，完成10個樣品的提取過程用時約14 h。而前述1.3.1部分的提取方法在萃取過程中不會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，且使用的實驗器皿少，試劑相對簡單，用量也少，完成10個樣品的提取過程用時約3 h，大大提高了檢測效率。

2.2 凈化小柱的比較

GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006兩標準分別用WCX和SCX做凈化小柱。WCX與SCX都是陽離子交換柱，采用乙醇／甲醇活化，水、上樣液溶劑平衡，上樣，再以水、乙醇／甲醇淋洗，最后用氨化乙醇／氨化甲醇洗脫的通用凈化方法對兩種SPE小柱的保留效果進行了比較。試驗發(fā)現(xiàn)，樣品液經(jīng)WCX小柱上樣后用水、乙醇淋洗，分別收集淋洗液，處理并吹干、進行衍生化，上機進樣，有目標物鹽酸克倫特羅檢出，且水淋洗的檢出量大于乙醇淋洗的結(jié)果，說明WCX小柱對鹽酸克倫特羅的保留效果不好，這一點在文獻［10］中也被提到。同時對SCX小柱進行考察，未發(fā)現(xiàn)在上樣、淋洗過程有目標物損失的情況，實驗效果良好，可獲得較為滿意的結(jié)果。

2.3 采集離子的選擇

采用SIM方式對GB／T 5009.192-2003和NY／T 468-2006提供的6個監(jiān)測離子m／z 86，187，243，262，212，277進行掃描，得到鹽酸克倫特羅標準品衍生物的選擇性離子質(zhì)譜圖，如圖1所示。選用離子豐度最大的碎片m／z 86作為定量離子，豐度較大的m／z 262，243，187作為定性離子。

圖1 鹽酸克倫特羅標準品（256 ng／mL）衍生物的選擇離子質(zhì)譜圖

圖2為步驟1.2的儀器條件下，空白豬肉樣品中添加鹽酸克倫特羅的總離子流圖和碎片離子流圖，目標物出峰時間為12.137 min，總離子流圖和各監(jiān)測離子流圖均未見干擾峰。

2.4 標準工作曲線

圖2 添加濃度6.40 μg／kg鹽酸克倫特羅的總離子流圖（a）及各監(jiān)測離子流圖（b）

取一定量的鹽酸克倫特羅標準品，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為400 mg／L的標準儲備液，再稀釋成一定濃度的中間標準溶液，分別吸取一定體積到10 mL離心管后，按步驟1.3.2進行衍生，得到濃度分別為10.24，19.20，32.00，51.20，128.0，256.0，384.0，512.0 ng／mL的標準工作液系列，依次進行GC-MS采集，每點各進樣3針。

以定量離子（m／z 86）峰面積（A）對相應質(zhì)量濃度（ρ，ng／mL）進行線性回歸，得回歸方程為A=687.5526ρ-663.754 9，相關系數(shù)r=0.999 7，表明線性關系良好。

2.5 方法回收率及檢出限

利用在空白樣品中添加標準溶液的方法，按步驟1.3的樣品前處理方法對豬肉組織中鹽酸克倫特羅分別進行1.92，5.12，12.8 μg／kg 3水平的添加回收試驗，每個濃度點進行6個平行樣的同批次重復性檢驗及2個隨機日的日間重復性來考察檢測方法的穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

表1 豬肉樣品中不同添加水平下鹽酸克倫特羅的回收率、相對標準偏差（n1=6）及2日間重復性（n2=2）

由表1可知，分2日檢測的豬肉組織樣品中鹽酸克倫特羅3濃度點添加回收率在73.0%～84.8%之間，相對標準偏差在4.3%～8.2%之間。2日間3濃度點日間平均回收率分別為77.1%，81.2%，78.9%，相對應的日間相對偏差分別為5.3%，4.5%，1.3%。

在本實驗條件下，空白豬肉樣品中添加量為1.00 μg／kg時信噪比S／N＞3；添加量＜1.00 μg／kg時，背景干擾影響較大，定量離子的準確積分較困難。因此本方法的檢出限為1.00 μg／kg。

3 結(jié)語

對 標 準GB／T 5009.192-2003，NY／T 468-2006中提出的酸提取和乙酸乙酯提取方案、WCX和SCX小柱凈化方案進行了系統(tǒng)的比對研究，并對兩標準在實際檢測工作中的資源利用、工作時效、檢測可靠性進行了分析，確定了堿性乙酸乙酯提取-稀鹽酸反萃取-SCX小柱凈化-BSTFA衍生-SIM掃描（M／Z 86，262，243，187）-外標法定量相結(jié)合的檢測方案。該方法簡便、快速、可靠性較好，適用于日常對豬肉樣品中鹽酸克倫特羅檢測的定性、定量工作。

［1］ 陳海玲，郝春麗，黃華斌，等．高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定豬尿中克倫特羅和萊克多巴胺［J］．理化檢驗：化學分冊，2011，47(8): 859-860.

［2］ 吳銀良，李曉微，劉素英，等．氣相色譜-質(zhì)譜法測定肝臟組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺［J］．分析化學，2006，34(8): 1 083-1 086.

［3］ 謝勁心，林斯星．氣質(zhì)聯(lián)用法同時檢測尿液中的克倫特羅和萊克多巴胺殘留［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(8): 1 864-1 865.

［4］ 苗虹，鄒建宏，范塞，等．高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定尿液中β2-受體激動劑及β-受體阻斷劑［J］．色譜，2010，28(6): 572-578.

［5］ SN／T 1924-2007 進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法［S］.

［6］ 管健，王立媛，吳平谷，等．同位素作內(nèi)標氣質(zhì)聯(lián)機測定動物源食品中4種β2-興奮劑的含量［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(12): 2 194-2 196.

［7］ GB／T 5009.192-2003 動物性食品中克倫特羅殘留量的測定［S］.

［8］ NY／T 468-2006 動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質(zhì)譜法［S］.

［9］ 趙善貞，陳舜勝，鄧小軍，等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品的4種β-興奮劑殘留量［J］．理化檢驗：化學分冊，2009，45(8): 968-971.

［10］ 康莉，陳春曉，劉紅河，等．LC／MS／MS法測定豬肝中四環(huán)素類抗生素及鹽酸克倫特羅藥物殘留［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(12): 2 144-2 146.

Determination of Clenbuterol Residue in Pork by GC-MS

Li Ying, Wang Yihong, Wang Liang, Li Chanjun
（Testing Center for Quality of Agricultural Products, Zhengzhou 450006, China）

Extracted with ethyl acetate, purified with SCX cartridge, quantified by external standard, a method was established for the determination of clenbuterol in pork by GC-MS. The good linearity was showed in the range of 10.24-512.0 ng／mL with the correlation coeff i cients r=0.999 7. The recovery rates were ranged from 73.0% to 84.8% at the spiked levels of 1.92, 5.12, 12.80 μg／kg, with the relative standard deviations of 4.3%-8.2%（n=6）. The average recovery rates of the 3 concentrations in the two different day were ranged of 77.1%-81.2% and the relative deviations were 1.3%-5.3%. The results indicated that the method was precise, accurate, easy, fast and suitable to complete the determination of clenbuterol residue in pork on daily work.

gas chromatography-mass spectrometry; clenbuterol; pork sample; comparison of method

O658

A

1008-6145（2014）02-0043-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.012

聯(lián)系人：李鶯；E-mail: zixuan100@163.com

2013-12-26