張文文，王庚申，施 慧，謝建軍，許文軍

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316100；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda又名白蝦，其肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受群眾喜愛。同時由于其具有生長快、繁殖力強，繁殖周期短，適應(yīng)性廣，食性雜，經(jīng)濟價值高等特點，已成為浙江省重要的海水圍塘養(yǎng)殖混養(yǎng)品種。但隨著脊尾白蝦養(yǎng)殖面積的增加，病害也越來越多，給養(yǎng)民造成的損失也越來越嚴重[1]。

2012年7月，浙江省普陀區(qū)浙江省海洋水產(chǎn)研究所西閃試驗場暫養(yǎng)脊尾白蝦種蝦爆發(fā)紅體病，病蝦緩游于水面或靜伏于池邊，該病傳播快,死亡率高，一周內(nèi)發(fā)病死亡率達到30%左右（最高日死亡率達0.5%）。試驗材料為瀕死紅體病脊尾白蝦，通過病原分離、人工感染試驗、病原菌形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA和熱激蛋白HSP60基因序列同源性分析以及藥物敏感性試驗等方法，對此次引起脊尾白蝦紅體病的病原進行初步研究，以期為該病的有效防治提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料來源

病蝦樣品于2012年7月取自浙江舟山普陀區(qū)西閃試驗場的發(fā)病池塘，均為表現(xiàn)典型患病癥狀的瀕死個體，體重 0.51±0.02 g。

營養(yǎng)瓊脂、TCBS培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司；API 20NE細菌鑒定系統(tǒng)試劑條是法國生物梅里埃中國有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片是杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。TSA培養(yǎng)基系法國Becton公司產(chǎn)品。

Taq酶購自上海生物工程技術(shù)有限公司，pGEM—T Easy載體是Promega公司產(chǎn)品。

1.2 病毒 PCR 檢測

取癥狀典型的患病脊尾白蝦分別制備檢測用DNA模板和RNA模板，分別進行對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）和桃拉綜合癥病毒（TSV）PCR檢測。WSSV采用KIMURA[2]NEST-PCR引物，外引物：P1：5’ATCATGGCTGCTTCACAGAC 3’和 P2：5’GGCTGGAGAGGACAAGACAT 3’內(nèi)引物：P3：5’TCTTCATCAGATGCTACTGC 3’和 P4：5’TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3’；TSV 采用 OIE 手冊（2009 版）[3]推薦的引物，9195：5’TCAATGGAGCTTGGTCC 3’和 9992：5’AAGTAGACAGCCGCGCTT 3’。

1.3 細菌分離

取癥狀典型的患病脊尾白蝦，用70%酒精棉球?qū)ζ潴w表擦洗消毒，無菌條件下取心血淋巴液和肝胰腺，在營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基平板上劃線接種；27℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進行分離純化；在營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基上接種純化后的優(yōu)勢菌，27℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色及形態(tài)特征。將純化后的菌株置于含15%甘油的液體培養(yǎng)基中，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 人工感染試驗

1.4.1 感染用菌的準備

將實驗菌株接種新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面，27℃下恒溫培養(yǎng)（18～24 h），用無菌生理鹽水洗下菌苔，采用分光光度法（OD550 nm）結(jié)合活菌平板計數(shù)法，制成濃度為106～108個/mL的菌懸液備用。

1.4.2 人工感染試驗用蝦

采自本所試驗場圍塘養(yǎng)殖的健康脊尾白蝦，體重約0.41±0.07 g，選體表無損傷，體色正常的健康蝦作為試驗用蝦。健康蝦在室內(nèi)暫養(yǎng)3 d，無異常反應(yīng)后備用。

1.4.3 感染試驗

采用肌肉注射法，對健康脊尾白蝦的第2和第3腹節(jié)之間的肌肉進行注射，試驗每組設(shè)20尾，每尾注射50 μL菌液，分別為106～108個/mL的菌懸液（根據(jù)條件試驗后設(shè)定），對照組注射等量無菌生理鹽水。感染試驗在20 cm×50 cm玻璃缸水槽內(nèi)進行，試驗期間水溫控制在26～27.5℃，每天投喂南美白對蝦配合飼料，每日天換水并觀察其活動、攝食及死亡情況。對患病瀕死的脊尾白蝦取肌肉進行細菌再分離，試驗持續(xù)7 d。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察及生理生化試驗

將病原菌稀釋后涂布于TCBS瓊脂平板上，于27℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特征。革蘭氏染色光學(xué)顯微鏡觀察。同時用法國生物梅里埃公司API 20NE細菌鑒定系統(tǒng)進行生化反應(yīng)測試，并根據(jù)文獻[4]的方法選取有代表性的生化反應(yīng)，用細菌微量生化鑒定管補充生化試驗。

1.5.2 16 S rDNA 和 HSP60 基因序列分析

細菌DNA模板的制備：用細菌接種棒挑取純化的單菌落于100 μL無菌去離子水中，沸水煮5 min，冰浴5 min，4℃8 000 r/min離心10 min，取上清作為PCR反應(yīng)所用模板。

PCR擴增和測序：細菌16S rDNA基因通用引物為27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’和1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’；HSP60 基因 PCR 擴增簡并引物 H60F：5’-GGNGAYGGNACNACNACNGCNACNGT-3’，和 H60R：5’TCNCCRAANCCNGGNGCYTTNACNGC3’。PCR 采用 50 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成測序。用DNASTAR軟件處理測序得到的16S rDNA和HSP60基因序列，并將序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)中進行進行BLAST分析。HSP60基因序列的系統(tǒng)關(guān)系分析使用MEGA(version3.1)分析軟件，進行1 000次抽樣自展，鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

1.6 病原菌藥敏試驗

采用紙片擴散法，涂布接種病原菌于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，將藥敏紙片用無菌鑷子輕輕貼在平板表面，27℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的有無與直徑大小，依據(jù)藥敏標準判斷菌株對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 患病對蝦臨床癥狀

患病脊尾白蝦主要表現(xiàn)為蝦體全身性發(fā)紅，額劍發(fā)黑，反應(yīng)遲鈍，攝食減少或不攝食，肝胰臟腫大，腸胃空。

圖1 患病脊尾白蝦Fig.1 The diseased E.carinicauda

2.2 病毒 PCR 檢測

對患病蝦進行WSSV和TSV PCR擴增，結(jié)果顯示均為陰性。

圖2 脊尾白蝦WSSV的PCR檢測結(jié)果Fig.2 Deteced the WSSV infection of E.carinicauda by PCR

圖3 脊尾白蝦TSV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig3.Deteced the TSV infection of E.carinicauda by RT-PCR

2.3 病原菌的分離

從患病脊尾白蝦血淋巴和肝胰腺上分離到優(yōu)勢菌一株，命名為XS1207005。將優(yōu)勢菌在營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，結(jié)果均生長良好。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、顏色均一致，菌落邊緣規(guī)則，光滑、濕潤、不透明、乳白色菌落；在TCBS平板上呈黃色菌落，隆起，圓形，邊緣整齊。經(jīng)革蘭氏染色鑒定，XS1207005為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下可觀察到菌體呈短桿狀，分散排列，可運動。培養(yǎng)試驗表明，菌株XS1207005在15～30℃生長快，4℃和42℃不生長。

2.4 人工感染試驗結(jié)果

采用分光光度法（OD550 nm）結(jié)合活菌平板計數(shù)法，配制成濃度為 3.4×108、3.4×107、3.4×106CFU/mL的菌懸液。

感染試驗的結(jié)果表明，以XS1207005對健康脊尾白蝦進行攻毒感染后，在攻毒第1天即開始陸續(xù)死亡，7 d后均全部死亡。死亡對蝦表現(xiàn)出的紅體癥狀與患病對蝦相同；而對照組只有1尾對蝦死亡，且該蝦是因為脫殼時被其它對蝦捕食導(dǎo)致死亡(表1)。

表1 菌株XS1207005對脊尾白蝦攻毒試驗Tab.1 Virulence to E.carinicauda with strain XS1207005

2.5 病原菌的生理生化特征鑒定結(jié)果

對菌株XS1207005進行了主要理化特性的測定，詳見表2。結(jié)果表明，菌株XS1207005為革蘭氏陰性，油鏡下觀察菌體呈弧形短桿狀，可運動，大小約 1.4 μm×0.8 μm，兼性厭氧、發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵、氧化酶和接觸酶反應(yīng)均呈陽性、對弧菌抑制劑O/129(2，4-二氨基-6，7-二異丙基喋啶磷酸鹽，150 μg/mL)敏感等，符合弧菌屬的典型特征，征初步判定XS1207005菌株為弧菌屬(Vibrio)細菌。

表2 菌株XS1207005的生理生化結(jié)果Tab.2 Physiological and biochemical results of strain XS1207005

2.6 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

測序結(jié)果顯示菌株XS1207005的16S rDNA基因序列長度為1 516 bp。將該序列進行BLAST分析，結(jié)果顯示：菌株XS1207005與哈維氏弧菌V.harveyi最為接近，同源性高達99%，但16S rDNA基因序列結(jié)果顯示，菌株XS1207005與溶藻弧菌V.alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus的同源性也很高，最高達到98%。

試驗同時測定了菌株XS1207005的部分HSP60基因序列，序列長度為496 bp。BLAST分析顯示，該基因序列與弧菌屬細菌的HSP60基因序列的同源性較高（94%～100%）。其中，與哈維氏弧菌的HSP60序列同源性高達99.6%，而與其他弧菌屬細菌的HSP60基因同源性均小于91%。以菌株XS1207005的HSP60序列與相關(guān)種屬細菌的HSP60序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明，菌株XS1207005與哈維氏弧菌自然聚為一支，置信度為100%。

圖4 菌株 XS1207005的16S rDNA(a)和HSP60(b)基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplified products of 16S rDNA gene(a)and HSP60 gene(b)of strain XS1207005

2.7 藥敏試驗結(jié)果

采用紙片法測定菌株XS1207005對22種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果表明，病原菌對先鋒噻肟、復(fù)方新諾明、利福平、先鋒必、菌必治、氟哌酸、復(fù)方欣及氧氟沙星等8種藥物敏感；對先鋒V、青霉素G、萬古霉素、氨芐青霉素、苯青唑霉素等5種藥物不敏感，對頭孢拉定、紅霉素、呋喃妥因、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢呋肟等7種藥物中度敏感，詳見表3。

圖5 基于HSP60序列的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Vibrio based on HSP60 genes

表3 菌株XS1207005對不同抗菌藥物的敏感性Tab.3 Sensibility of strain XS1207005 to different antibacterial agents

3 討論

“紅體病”是蝦類養(yǎng)殖當中一種危害較大的常見疾病，其主要表現(xiàn)為病蝦蝦體發(fā)紅。但正如其他以癥狀命名的疾病一樣，“紅體”只是對蝦發(fā)生某些疾病后的一種表觀現(xiàn)象，事實上，研究發(fā)現(xiàn)能引起蝦類體色發(fā)紅的原因很多。周永燦等[5]曾報道溶藻弧菌和副溶血弧菌可以引起南美白對蝦紅體??；薛輝等[6]報道嗜水氣單胞菌是引起日本沼蝦紅體病的病原，葉雪平等[7]也報道了擬態(tài)弧菌是引起青蝦紅體綜合癥病原。根據(jù)南美白對蝦的“紅體病”的研究發(fā)現(xiàn)[8-11]，病毒、細菌和氨氮過高引起的環(huán)境突變均會引起對蝦出現(xiàn)紅體癥狀。本研究從患紅體病的脊尾白蝦中分離到一株優(yōu)勢菌株XS1207005，根據(jù)其菌落形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA和HSP60基因同源性分析結(jié)果，該菌與哈維氏弧菌相似，其中HSP60基因與哈維氏弧菌相應(yīng)片段同源性高達99.6%，將其鑒定為哈維氏弧菌。用該菌人工感染健康脊尾白蝦，其能使健康蝦發(fā)病，且表現(xiàn)出與自然感染病蝦相似的癥狀，因此，可以確定哈維氏弧菌為引起此次暫養(yǎng)脊尾白蝦紅體病的病原。

哈維氏弧菌在海水中是較常見的優(yōu)勢菌群，廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數(shù)量眾多，是海水類弧菌之首，為海洋中正常菌群之一，在多種海洋動物中均存在。哈維氏弧菌是魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖品種的條件性致病菌，研究認為宿主的生理狀態(tài)、養(yǎng)殖環(huán)境的理化條件均與哈維氏弧菌的致病性密切相關(guān)[12]。本次發(fā)病的脊尾白蝦是從圍塘捕獲后暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池，養(yǎng)殖密度變大，同時養(yǎng)殖管理也相應(yīng)發(fā)生了變化，養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生的這些變化因素使脊尾白蝦造產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。在應(yīng)激期間，脊尾白蝦的自身免疫力會急劇下降，此時對蝦就會極易因感染水體中的條件性致病菌而發(fā)病。

在對蝦養(yǎng)殖中，改善水質(zhì)、定期消毒水體、在餌料中添加Vc和免疫多糖等免疫增強劑以及消毒后投放有益微生物制劑等方法，可以有效預(yù)防這類由條件致病菌引起疾病?？咕幬锏氖褂檬侵委熢擃惣膊〕Ｓ玫氖侄巍Ｋ幟艚Y(jié)果顯示：從發(fā)病蝦上分離到的病原菌對復(fù)方新諾明、氧氟沙星、氟派酸等高度敏感，本試驗以口服藥餌結(jié)合水體消毒的方法進行治療，取得了明顯的療效。

紅體病也是近年脊尾白蝦養(yǎng)殖過程當中重要的一種疾病，但目前還無有關(guān)脊尾白蝦“紅體病”病原的研究報道，而哈維氏弧菌引起蝦類紅體病的報道也尚屬首次，有關(guān)蝦體發(fā)紅的機理，有待于進一步研究。

[1]許文軍,謝建軍,施 慧,等.池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦感染血卵渦鞭蟲的研究[J].海洋與湖沼,2010,41(3):1-6.

[2]KIMURA T,YAMANO K,NAKANO H,et al.Detection of penaeid rod-shaped DNA virus(PRDV)by PCR[J].Fish Pathol,1996,31(2):93-98.

[3]世界動物衛(wèi)生組織(OIE).水生動物疾病診斷手冊[M].國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:172-209.

[4]中國科學(xué)院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京:科學(xué)出版社,1978.

[5]周永燦,張 本,陳雪芬,等.養(yǎng)殖對蝦細菌性紅體病的初步研究[J].海洋科學(xué),2003,27(5):61-65.

[6]薛 暉,陸全平,馬小榮,等.日本沼蝦“紅體病”病原的研究[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2004,25(5):35-37.

[7]葉雪平,羅毅志,楊廣智,等.青蝦紅體綜合癥病原研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,21(2):106-108,122.

[8]張 坷,萬 志.南美白對蝦三種類型紅體病的防治方法[J].北京水產(chǎn),2004(4):34.

[9]ALAPIDE T E V,DUREZA L A.Isolation of Vibrio spp.From Penaeus monodon(Fabricius)with red disease syndrome[J].O-ceanographic Literature Review,1998,45:362-367.

[10]AGUIRRE G,GABRIEL,ASCENCIO V,et al.Infectious disease in shrimp species with aquaculture potential[J].Resent Res Devl Microbiology,2000,4:333-348.

[11]孫克年.南美白對蝦紅體病的臨床鑒別與防治[J].內(nèi)陸水產(chǎn),2007(5):25-26.

[12]張曉華,鐘英斌,陳吉祥.哈維氏弧菌的生物學(xué)特性、流行病學(xué)及檢測技術(shù)[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,37(5):740-748.