趙滿意，王偉洪，張健兵，鐘愛華，儲張杰，樓 寶

（1.浙江海洋學院水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316100）

蒙古裸腹溞是目前唯一可在海水中大量培養(yǎng)的鹽水枝角類[1]，作為鹵蟲的替代產(chǎn)品，其在海水魚苗培育中的應用和生產(chǎn)性培養(yǎng)正日益受到重視。種群的數(shù)量變動理論上是出生率與死亡率的變動，其中出生率與生殖量、種群性比等指標相關(guān)，因此，雄體產(chǎn)生機理和誘導因素的研究，是研究枝角類等生物餌料種群數(shù)量動態(tài)變化機理和規(guī)?；囵B(yǎng)研究的重要內(nèi)容。一般認為，枝角類孤雌生殖和兩性生殖兩種生殖方式均與環(huán)境條件相關(guān)[2-5]，但至今關(guān)于枝角類的生殖機制研究不多，尤其是兩性生殖機理很不清楚。相關(guān)的前期研究表明[1]，蒙古裸腹溞的雄體來源于母體的產(chǎn)出，進行孤雌生殖的母體在良好環(huán)境條件（溫度、鹽度和食物等適宜，低溞密度條件）下，產(chǎn)出的幼體幾乎都是孤雌生殖雌體，產(chǎn)雄率極低，而隨著溞密度的上升及溫度和餌料密度等因子的改變，產(chǎn)雄率變化很大。本研究在這些相關(guān)研究基礎(chǔ)上，著重研究較高溫度條件下（25～30℃），種群密度和食物密度變化對蒙古裸腹溞產(chǎn)雄的誘導效應，以期進一步掌握蒙古裸腹溞的繁殖特性，并為蒙古裸腹溞的規(guī)?；囵B(yǎng)和枝角類生殖生理等研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 溞種來源

實驗溞種由上海海洋大學生理生態(tài)重點實驗室提供，源于1982年采自晉南地區(qū)半咸水湖，在浙江海洋學院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室內(nèi)以海水連續(xù)孤雌生殖繁衍保存下的溞種。

1.2 實驗條件與餌料

實驗在 RXZ 人工氣候箱內(nèi)進行，設(shè)定溫度為（28±0.5）℃，光照 3 000～4 000 lx，光暗周期（L：D）為 12：12；鹽度27.5±0.5；培養(yǎng)液由實驗條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期的海水小球藻Chlorella sp.配制而成。

1.3 實驗設(shè)計和方法

1.3.1 實驗設(shè)計

實驗設(shè)初始溞數(shù)量為1 ind/mL（低溞密度）、3 ind/mL（中溞密度）、6 ind/mL（高溞密度）三個水平，按培養(yǎng)液更換間隔設(shè)固定和機動兩組，固定組設(shè)1次/12 h和1次/6 h更換培養(yǎng)液兩組，機動組是藻液更換次數(shù)視藻液濾淡（清）情況而定。各實驗組均設(shè)3個重復。

1.3.2 實驗用溞

實驗用溞均為實驗條件下，0.2 ind/mL密度下4 h內(nèi)產(chǎn)出的同齡幼體。在更換的藻液密度 (3～4)×106cells/ml，24 h更換培養(yǎng)液一次的實驗條件下，選取單個培養(yǎng)連續(xù)3個世代以上的溞1個，產(chǎn)出第一窩幼溞后，移走母溞，培養(yǎng)幼溞，并以同樣方法，始終控制培養(yǎng)密度在0.2 ind/mL以下，擴大培養(yǎng)至第一窩產(chǎn)出幼溞能滿足實驗用溞數(shù)量需要。實驗開始時，選取在4 h內(nèi)基本同步產(chǎn)出的幼溞，挑至1只1 000 mL燒杯中混合，然后再用吸管隨機吸至各實驗組。

1.3.3 實驗方法

實驗均在50 mL燒杯中進行，控制培養(yǎng)容積誤差（50±5）mL，溞密度為低、中、高各處理初始實驗組幼溞數(shù)分別為50個、150個、300個，培養(yǎng)液（藻液）更換密度均為(3～4)×106cells/mL。每次產(chǎn)幼前，及時隨機抓取育兒囊高起快產(chǎn)幼的溞10個，放至空白燒杯繼續(xù)培養(yǎng)至幼體全部產(chǎn)出后，將母溞放回原燒杯，計數(shù)產(chǎn)出幼溞總數(shù)和其中的雄體數(shù)，另在固定1次/12 h各溞密度組產(chǎn)第一窩時，隨機抓取育兒囊高起快產(chǎn)幼的溞27個（即每個燒杯抓取3個母溞），在空白燒杯中1杯1個培養(yǎng)至幼體全部產(chǎn)出后，將母溞放回原燒杯，計數(shù)產(chǎn)出幼溞總數(shù)和其中的雄體數(shù)。實驗至第四窩雌雄鑒別后結(jié)束。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

窩產(chǎn)幼數(shù)=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)

總產(chǎn)幼數(shù)=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)之和

窩生殖量=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)/（存活溞總數(shù)-形成的兩性生殖雌體數(shù)）

窩雄體百分率=每窩產(chǎn)出幼體中的雄體數(shù)/每窩產(chǎn)幼數(shù)(窩生殖量)×100%

平均雄體百分率=累計產(chǎn)出幼體中的雄體數(shù)/累計產(chǎn)幼總數(shù)(總生殖量)×100%

窩平均產(chǎn)出時間=Σ(次產(chǎn)幼數(shù)×次產(chǎn)幼時間)/窩產(chǎn)幼數(shù)，次產(chǎn)幼數(shù)指每次觀察時已產(chǎn)出的幼體數(shù)，次產(chǎn)幼時間均取相鄰檢查記錄時間的中值

雄體產(chǎn)出效率=(累計)產(chǎn)幼總數(shù)×(平均)雄體百分率/平均產(chǎn)出時間×1 000 mL/50 mL(ind/d·L)，指 1 L水體平均每天產(chǎn)出的雄體數(shù)；其中，平均產(chǎn)出時間=Σ(次產(chǎn)幼數(shù)×次產(chǎn)幼時間)/累計產(chǎn)幼總數(shù)

實驗數(shù)據(jù)方差分析取P＜0.05為差異顯著標準，均值比較均按Duncan法分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出率

至第4窩產(chǎn)幼結(jié)束，不同培養(yǎng)條件下的平均雄體產(chǎn)出率范圍為0.14%～13.01%，以溞密度3 ind.ml-1×培養(yǎng)液更換1次/12 h組最高，溞密度1 ind/mL×培養(yǎng)液機動更換組最低。從圖1和圖2可以看出，平均產(chǎn)雄率，相同培養(yǎng)液更換條件下，不同溞密度間差異較大，以中溞密度（3 ind/mL）最高，高溞密度（6 ind/mL）其次，低溞密度（1 ind/mL）最低；而在相同溞密度條件下，以固定組1次/12 h最高，固定組1次/6 h和機動組則差異不大，約為固定組1次/12 h的50%左右。從圖3可知，不同培養(yǎng)液更換條件，固定組1次/12 h和1次/6 h均表現(xiàn)為中溞密度＞高溞密度＞低溞密度規(guī)律，尤以固定組1次/12 h的差異更明顯，機動組則表現(xiàn)為隨溞密度降低而降低規(guī)律，而在不同溞密度下，中、低溞密度時均表現(xiàn)為固定組1次/12 h＞固定組1次/6 h＞機動組規(guī)律，高溞密度時則表現(xiàn)為機動組﹥固定組1次/12 h＞固定組1次/6 h。方差分析結(jié)果表明，溞密度和培養(yǎng)液更換方式對平均產(chǎn)雄率有較強的交互作用。

圖1 不同培養(yǎng)液更換方式下至第4窩的平均雄體百分率Fig.1 Average male ratio of 4 broods neonates in different algae replace

圖2 不同溞密度下至第4窩的平均雄體百分率Fig.2 Average male ratio of 4 broods neonates in different population density

圖3 不同培養(yǎng)條件下至第4窩的平均雄體百分率Fig.3 Average male ratio of 4 broods neonates in different experimental combination

2.2 不同培養(yǎng)條件下的窩雄體產(chǎn)出率

由表1可知，不同培養(yǎng)條件下，第1窩均有雄體產(chǎn)出，且窩產(chǎn)雄率差異極大，變動范圍 0.54%～29.00%，以溞密度 3 ind/mL、培養(yǎng)液更換1次/12 h組最高，溞密度1 ind/mL、培養(yǎng)液機動更換組最低；第2窩只有部分組別有雄體產(chǎn)出，且產(chǎn)出率遠低于或低于同組別第1窩，而第3、第4窩各組別均未發(fā)現(xiàn)有雄體產(chǎn)出。

由表2可知，在27個單個母溞的第1窩產(chǎn)出幼體中，有13個母溞產(chǎn)出幼體全部都是雌體（雄體產(chǎn)出率為0），占全部母溞的48.15%；其他14個都有雄體產(chǎn)出，占全部母溞的51.85%，窩雄體產(chǎn)出率最高可達60.00%，最低16.67%，其中高于或等于50%的有3個，40%～49%的有2個，30%～39%的有3個，低于30%的6個，但沒有1個母溞1窩產(chǎn)出幼體是全雄的。

表1 不同培養(yǎng)條件下的窩雄體百分率（%）Tab.1 Male ratio of different broods in different experimental combination（%）

表2 固定組1次/12 h×3 ind/mL組合的第1窩幼體數(shù)和雄體數(shù)Tab.2 The number of neonates and males in the first brood of 1times/12 h×3 ind/mL combination

2.3 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率

由于雄體的產(chǎn)出主要集中于第1窩，第3窩和第4窩均未有雄體產(chǎn)生，不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率基本上都隨培養(yǎng)時間增加而降低。由表4可知，至第一窩產(chǎn)出，雄體產(chǎn)出效率范圍為0.15～7.78 ind/（d·L），以固定組1次/12 h×3 ind/mL組合最高，機動組×6 ind/mL組合其次，機動組×1 ind/mL組合最低，至第4窩產(chǎn)出，最高的固定組1次/12 h×3 ind/mL組合從7.78 ind/（d·L）下降到3.52 ind/（d·L）。

從圖4可以看出，至第4窩的平均雄體產(chǎn)出效率，相同溞密度時，高溞密度下，培養(yǎng)液更換兩固定組差異不顯著，機動組顯著高于二者；低溞密度下，三組均較低，機動組接近于0，兩固定組略高于機動組且兩者差異不顯著；中溞密度下，三組相對均較高，其中固定組1次/6 h與機動組差異不顯著，但固定組1次/12 h遠高于二者；相同培養(yǎng)液更換方式下，兩組固定組均表現(xiàn)為中溞密度時最高，高溞密度和低溞密度均較低且兩者間差異不顯著，而機動組則表現(xiàn)為隨溞密度降低而顯著降低。

3 討論

3.1 蒙古裸腹溞的產(chǎn)雄特性

曹文清等[6]通過染色體組型研究發(fā)現(xiàn)，蒙古裸腹溞的幼體在育兒囊中已產(chǎn)生雌雄性分化，即雄體在胚胎發(fā)育期形成，但胚胎發(fā)育的雌雄性分化是卵的差異還是胚胎發(fā)育過程中受外界環(huán)境因素誘導所致，目前尚不清楚。關(guān)于枝角類雄體產(chǎn)生的機理，是內(nèi)部因素控制的生存對策，還是環(huán)境因子的誘導作用，抑或兩者的共同作用，不同學者間存在分歧[8-18]。在本研究實驗用溞制備過程中，檢測單個母溞的窩生殖量和產(chǎn)雄率時發(fā)現(xiàn)，窩生殖量8～13個，產(chǎn)出幼體幾乎都是孤雌生殖雌體，偶有雄體發(fā)現(xiàn)，即在很低溞密度和相對較高藻密度情況下，有個別母溞可有雄體產(chǎn)出，但產(chǎn)出率極低。依據(jù)本研究實驗結(jié)果，作者初步分析認為，蒙古裸腹溞雄體的產(chǎn)出應與母溞個體有關(guān)，不同個體產(chǎn)雄率的差異主要在于個體差異和誘導因素強弱，排入育兒囊的不同卵之間可能不同質(zhì)，即可能存在基因型及卵的大小、卵黃含量多少等差異，不同卵在胚胎發(fā)育時也可能不均等，這些因素都可能導致初生幼溞的個體差異，由此，不同個體在生長發(fā)育過程中對外界環(huán)境條件的反應敏感性有一定差異，從而導致相同條件下個體間存活率、壽命、生殖量、產(chǎn)雄率等差異。

表3 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率Tab.3 Efficiency of male reproduction in different experimental combination

圖4 不同培養(yǎng)條件下至第4窩的雄體產(chǎn)出效率Fig.4 Efficiency of male reproduction in different experimental combination

在本研究檢測的27個母溞中，有48.15%的母溞一窩幼體是全雌的，但沒有1個母溞一窩幼體是全雄的，這與盧芳野[7]等在食物不足、低溞密度及擁擠水等條件下，出現(xiàn)雄體的72窩中，全是雄體的窩數(shù)占65%的研究結(jié)果完全不同。處理本研究實驗數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)條件下的平均窩生殖量表現(xiàn)為隨溞密度增加而下降，隨培養(yǎng)液更換次數(shù)增加而增加，變動范圍2.14～6.02個，在溞密度6 ind/mL-1、培養(yǎng)液更換1次/12 h組合中，平均窩生殖量已降至2～3個，但也沒有發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)全雄的窩數(shù)。蒙古裸腹溞是否具產(chǎn)全雄窩次特性及單依賴溞密度和藻密度波動是否能誘導蒙古裸腹溞產(chǎn)全雄窩次尚有待進一步研究。至于同一個體第2窩之后產(chǎn)雄率的降低或不產(chǎn)雄，作者認為這可能是母溞的環(huán)境適應性所致，環(huán)境因子誘導母溞產(chǎn)出雄體必定與母溞對環(huán)境因子的敏感性有關(guān)，母溞從自身產(chǎn)出到產(chǎn)第一窩幼體處于幼齡至成齡生長發(fā)育期，是發(fā)育的關(guān)鍵階段，可能對環(huán)境因子的變化較敏感，從而易導致雄體產(chǎn)生，而從第二窩起則都是成齡生長期，經(jīng)歷幼齡期的環(huán)境適應后，母溞對環(huán)境因子的敏感性可能已下降或已不敏感，處于“相對適宜”的環(huán)境條件狀態(tài)而使產(chǎn)雄率下降或不產(chǎn)雄。改變環(huán)境因子的強度是否能提高母溞第2窩以后的雄體產(chǎn)出率尚有待進一步研究。

3.2 不同培養(yǎng)條件下蒙古裸腹溞的產(chǎn)雄率與產(chǎn)雄效率

本研究中，窩產(chǎn)雄率指每窩產(chǎn)出幼體中的雄體百分率，與每窩中的雄體產(chǎn)出數(shù)和產(chǎn)出幼體總數(shù)即窩生殖量相關(guān)，反映一定條件下的單窩產(chǎn)雄特性；平均產(chǎn)雄率是指至第4窩產(chǎn)幼結(jié)束時累計產(chǎn)出幼體中的累計雄體百分率，反映整個生殖過程的產(chǎn)雄特性。本研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件下，蒙古裸腹溞雄體的產(chǎn)出基本集中于第1窩，第2窩至第4窩產(chǎn)出雄體數(shù)大幅下降或無，4窩的平均產(chǎn)雄率隨窩次增加而降低，這反映在特定培養(yǎng)群體中的雄體比率必然隨培養(yǎng)時間波動，在種群增長前期很低，快速增長期和相對生長下降期相對較高，相對穩(wěn)定期則又較低。

雄體產(chǎn)出效率，即1 L水體平均每天產(chǎn)出的雄體數(shù)，由單位時間內(nèi)的累計產(chǎn)幼總數(shù)、平均雄體百分率和平均產(chǎn)出時間等因素決定。檢測過程發(fā)現(xiàn)，中、高溞密度下有4%～11.89%的母溞轉(zhuǎn)化形成兩性生殖雌體，低溞密度下則無或偶有產(chǎn)生，這導致中、高溞密度下實際可產(chǎn)幼孤雌生殖母溞數(shù)下降。另外，從表4可知，幼體的平均產(chǎn)出時間有隨溞密度增加而增加，隨培養(yǎng)液更換次數(shù)增加而降低趨勢，在第1窩生殖時差異基本不顯著，至第2窩最大差異1.55 d，至第4窩則可達近3 d的差異。低溞密度時窩產(chǎn)雄率和平均產(chǎn)雄率低，高溞密度時可產(chǎn)幼孤雌生殖母溞數(shù)和窩生殖量均下降，產(chǎn)幼總數(shù)降低，同時幼體平均產(chǎn)出時間增加等，由此，雄體產(chǎn)出效率在中溞密度時相對較高，而雄體產(chǎn)出基本集中于第1窩的特性，使雄體產(chǎn)出效率隨培養(yǎng)時間增加而降低。

3.3 溞密度和藻密度對蒙古裸腹溞產(chǎn)雄的誘導效應

本研究結(jié)果充分表明溞密度和藻密度波動是誘導蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)生的兩個重要因素。對雄體產(chǎn)出率，溞密度和培養(yǎng)液更換方式兩者有較強交互作用，低溞密度下，不同培養(yǎng)液更換方式下均很低，但中、高溞密度時則與培養(yǎng)液更換方式相關(guān)。作者分析認為，溞種群的密度效應包含溞個體間的碰撞頻率和代謝分泌物濃度效應，與溞種群的數(shù)量、個體大小、運動能力與強度等有關(guān)，并受溫度、光強、藻密度等因素影響，而在固定更換藻液密度條件下，培養(yǎng)液更換方式實質(zhì)影響的是藻密度的波動大小、溞群體代謝分泌物濃度變化及培養(yǎng)液pH等整體環(huán)境因子，使這些因子呈現(xiàn)周期性動態(tài)變化規(guī)律，培養(yǎng)液更換間隔越短，波動越小，間隔越長，波動越大，其中，影響最大的是藻密度的波動幅度。由于溞群體的濾食效應和藻細胞的生長繁殖，低溞密度下，溞群體的濾食效應與藻細胞的生長繁殖速度可能差異不大，在一個更換期內(nèi)藻密度的波動均較小，而高溞密度下，溞群體的濾食效應強于藻細胞的繁殖速度，在一個更換期內(nèi)，藻密度波動程度較大，固定組1次/12 h二次更換期間有3～6 h的藻液濾清時間，固定組1次/6 h在第一次產(chǎn)幼前培養(yǎng)液更換前后藻密度變化不大，之后也有較大的下降。相關(guān)研究表明[10-18]，溞密度和食物密度對枝角類個體的呼吸率、消化率、攝食強度及活動和代謝等一系列生命活動有一定影響，目前尚未有相關(guān)證據(jù)表明這是溞密度和藻密度誘導蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)生的內(nèi)在機理，但根據(jù)本研究結(jié)果可以推論，增加溞密度和藻密度波動幅度均有提高蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)出率的效應。

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