王建忠等

摘要：采用改進的QuEChERS方法，利用UPLC-MS/MS檢測分析，建立了葉菜類（油菜、芹菜）、甘藍類（甘藍）、根莖類（莖用萵苣）、茄果類（辣椒、番茄）和豆類（豇豆）5大類8種蔬菜77種農(nóng)藥殘留的分析方法。樣品用乙腈提取，提取液經(jīng)鹽析后，經(jīng)氨基粉（NH2）、C18和石墨化炭黑（GCB）的混合粉末凈化，采用UPLC-MS/MS在正負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測掃描方法進行檢測，結(jié)果表明：組合凈化劑結(jié)合乙腈液分配凈化可有效去除雜質(zhì)干擾；以豇豆為首試對象，77種農(nóng)藥的定量下限（LOQ）范圍在0.001～0.1 mg/kg之間，在0.5 LOQ、1 LOQ、2 LOQ、5 LOQ、10 LOQ和 20 LOQ 的添加水平下，空白添加濃度范圍內(nèi)線性良好（r2≥0.990）；8種蔬菜分別在0.01、0.05 、0.1 mg/kg 3種濃度水平下進行添加回收試驗，該方法的平均回收率為77.4%～100.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%～12.4%。結(jié)果表明： 本方法簡便、快速、安全、價格低廉、重現(xiàn)性良好，具有一次處理樣品可同時測定77種農(nóng)藥殘留的特點，適合于不同種類蔬菜中多農(nóng)藥殘留的高通量定量檢測。

關(guān)鍵詞：改進QuEChERS方法；UPLC-MS/MS方法；蔬菜；農(nóng)藥殘留；快速檢測

中圖分類號： S481.+8 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0248-05

收稿日期：2013-12-17

基金項目：遼寧省科技攻關(guān)（編號：2011215004）。

作者簡介：王建忠（1972—），男，江蘇連云港人，碩士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究。Tel：（024）31023348；E-mail：wjz721125@sina.com。農(nóng)藥殘留檢測方法很多，包括色譜方法、免疫分析法、生物傳感器法等[1]，其中的色譜技術(shù)是大多數(shù)國家規(guī)定的技術(shù)，但此類方法的樣品前處理復(fù)雜。隨著農(nóng)藥殘留監(jiān)測工作的深入開展，對檢測技術(shù)的要求越來越高，并向著簡單、快速、靈敏、多殘留、低成本和易推廣的方向發(fā)展。無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，都把如何準(zhǔn)確快速地完成檢測工作作為農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究的熱點。目前，我國農(nóng)藥殘留檢測方法主要有兩大類：農(nóng)藥殘留快速檢測法和色譜法。農(nóng)藥殘留快速檢測法易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[2]。而色譜法更為精確，其中的液質(zhì)聯(lián)用法在色譜法中的應(yīng)用范圍和所起作用日益突出。在農(nóng)藥多殘留檢測分析中，因農(nóng)產(chǎn)品的種類非常多，就蔬菜而言，常見的也有上百種，因此，檢測過程中的基質(zhì)影響不可避免，樣品凈化是分析檢測過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的就是最大限度地提取目標(biāo)物，把干擾降到最低、誤差降到最小，所以樣品前處理直接影響結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性。

基質(zhì)影響是1993年Tang等[3]首先觀察了的現(xiàn)象， 它是指分析物在標(biāo)準(zhǔn)溶液和生物基質(zhì)中的響應(yīng)值產(chǎn)生差異， 根據(jù)其響應(yīng)值被加強還是減少描述為離子抑制或離子增強?；|(zhì)效應(yīng)主要由溶液中非揮發(fā)性或弱揮發(fā)性物質(zhì)影響分析物帶電霧滴的形成或揮發(fā)效率所致，目前基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的具體機制雖還未清楚[4]，但從客觀上分析來看，其產(chǎn)生不僅與樣品中除分析物以外的其他成分的組成及含量有關(guān)，還與分析系統(tǒng)的方法、試劑、進樣方式等有關(guān)[5]。

QuEChERS方法是樣品預(yù)處理方法，是Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe的英文簡稱，即快速、容易、便宜、有效、耐用和安全。2003年Anastassiades等[6]首次報道用于蔬菜和水果的預(yù)處理。其實質(zhì)是將傳統(tǒng)的液液萃取、分離和基質(zhì)固相分散技術(shù)組合起來的預(yù)處理方法，我國自2005年引進QuEChERS方法。但自QuEChERS方法建立以來，大部分的分析工作者只是對方法操作步驟的引用，對于該方法各操作過程的影響因素及量化并未做進一步探討。本試驗正是基于8種蔬菜的復(fù)雜基質(zhì)影響，對QuEChERS方法進行探索性改進，調(diào)整檢測條件，改善前處理條件，就提取溶劑比較、吸附劑的選擇、用量比例等對樣品凈化效果的影響因素進行了研究，提出77種農(nóng)藥殘留在8種蔬菜中的UPLC-MS/MS色譜檢測方法。

1材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜儀及XEVO TQ MS三重四極桿質(zhì)譜儀（Waters公司）；固相吸附劑有伯仲胺（PSA）、氨基粉（NH2）、C18、石墨化炭黑（GCB）（天津博納艾杰爾科技有限公司）；聚丙烯塑料離心管（新康醫(yī)療器械有限公司）；乙腈氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鎂、甲醇和有機濾膜（北京迪馬科技有限公司）；所用供試農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，試劑為分析純或色譜純，水為超純水。

1.2供試蔬菜的確定

所選擇的甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、胡蘿卜、辣椒、番茄和豇豆8種蔬菜，涉及葉菜類、甘藍類、根莖類、茄果類和豆類5大類，基本涵蓋人們?nèi)粘ＯM的蔬菜品種，也基本包括了蔬菜的不同生育特點，基質(zhì)干擾差異較大，對檢測方法的適用性有很大提高。8種供試蔬菜為市售蔬菜。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稱取各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確至0.01 mg），置于50 mL容量瓶中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性選擇甲醇、乙腈或丙酮-正己烷（體積比1 ∶1）溶解并定容，配制成濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)靈敏度，確定其在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度（表1）。依據(jù)每種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度以及標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度，移取一定量的單個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液在4 ℃避光保存，可使用6個月。

1.4樣品前處理方法

1.4.1提取準(zhǔn)確稱取粉碎后的蔬菜樣品5 g（精確至 0.01 g），置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋提取2 min，加入1 g氯化鈉，渦旋1 min，4 000 r/min離心 5 min，靜置待乙腈相和水相分層。endprint

1.4.2凈化取2 mL上層乙腈相溶液置于裝有50 mg C18、50 mg NH2和10 mg GCB的10 mL離心管中，渦旋1 min，4 000 r/min 離心5 min，取0.5 mL上清液，加入0.5 mL甲醇-水溶液（體積比50 ∶50），混勻，過0.22 μm有機濾膜，LC-MS/MS 檢測。

1.5檢測條件

1.5.1色譜條件色譜柱：Acquity BEH RP18柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈（A相）和0.1%甲酸水溶液（B相）為流動相進行線性梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～20 min，A相的比例由5%線性變化至95%，20～22 min，A相的比例保持5%；流速為0.2 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件電噴霧正負(fù)離子電離模式（ESI+和ESI-）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度：380 ℃，脫溶劑氣速率：550 L/h，錐孔反吹氣速率：50 L/h。檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM），按保留時間進行農(nóng)藥組分監(jiān)測。

2結(jié)果與分析

2.1流動相的選擇

本研究分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇- 0.1%甲酸水和乙腈- 0.1%甲酸水為流動相，按照“1.5.1”節(jié)中的梯度洗脫條件進行檢測，結(jié)果表明，0.1%的甲酸水比水效果好，有利于提高待測物的離子化效率，從而提高待測物的靈敏度。此外，乙腈比甲醇洗脫效果好。以乙腈- 0.1%甲酸水為流動相，農(nóng)藥分離效果最好，色譜峰尖銳、對稱，響應(yīng)靈敏度最高。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將農(nóng)藥分別配制成1 μg/mL的單個標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蠕動泵注射的方式分別將單標(biāo)進質(zhì)譜，在電噴霧（ESI）電離模式下分別對每種農(nóng)藥進行一級全掃描，確定分子離子，并優(yōu)化得到分子離子響應(yīng)信號最高時的錐孔電壓。然后將其分子離子打碎，進行二級質(zhì)譜全掃描，每種農(nóng)藥找到2個子離子，要求子離子的質(zhì)核比（m/z）盡量大于100，且響應(yīng)信號較穩(wěn)定，分別優(yōu)化得到子離子響應(yīng)信號最高時的碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描方式進行掃描。按照殘留分析確證檢測的要求，每個母離子選擇2個子離子用來定性，并以豐度較強的子離子用來定量。絕大多數(shù)農(nóng)藥在電噴霧正離子模式下（ESI+）均能產(chǎn)生較強的[M+H]+分子離子，少數(shù)農(nóng)藥在電噴霧負(fù)離子模式下（ESI-）[M-H]- 產(chǎn)生分子離子，如咪草煙和氟磺胺草醚等。

按照保留時間排序，編輯多反應(yīng)監(jiān)測掃描方法，進行分段采集。這樣可以提高單位時間內(nèi)離子的掃描次數(shù)，從而提高檢測靈敏度。最后篩選得到的77種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

2.3定容溶液的選擇

2.7方法的準(zhǔn)確度與精密度

考慮到國內(nèi)絕大多數(shù)農(nóng)藥殘留限量均大于0.01 mg/kg，在豇豆中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收試驗，平行分析5次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，在3種添加水平下，77種農(nóng)藥的平均回收率在77.4%～100.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在6.7%～12.4%之間，符合檢測方法驗證的要求。考慮到前處理方法中除雜所用的混合吸附劑的各自作用，開展基質(zhì)效應(yīng)對所建立方法的影響分析，進行方法的適用性驗證。選擇了其他7種蔬菜品種甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、辣椒、番茄和胡蘿卜，同樣在0.01、0.05、0.1 mg/kg 3種濃度水平下進行添加回收試驗。結(jié)果顯示，77種農(nóng)藥在甘藍中的平均回收率為77.4%～100.7%， RSD在6.7%～12.4%之間；油菜中的平均回收率為76.9%～93.1%，RSD在5.6%～137%之間；芹菜中的平均回收率為82.3%～103.4%，RSD在7.4%～10.7%之間；莖用萵苣中的平均回收率為77.2%～108.7%，RSD在7.8%～11.4%之間；辣椒中的平均回收率為78.1%～1089%，RSD在8.1%～10.7%之間；番茄中的平均回收率為71.6%～94.0%，RSD在5.8%～15.8%之間；胡蘿卜中的平均回收率為81.2%～92.6%，RSD在3.2%～17.6%之間。表明針對77種農(nóng)藥殘留所建立的檢測方法同樣適用于甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、辣椒、番茄和胡蘿卜中農(nóng)藥多殘留的測定。

3結(jié)論與討論

本研究根據(jù)農(nóng)藥的理化性質(zhì)，并結(jié)合遼寧省的農(nóng)藥使用情況，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)，通過對色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化確定，利用改進后的QuEChERS方法，建立了不同種類蔬菜中77種農(nóng)藥多殘留的分析方法。

在定容溶劑的選擇試驗后，確定了甲醇-0.1%甲酸水[V（甲醇） ∶V（0.1%甲酸水）=70 ∶30]的定容溶劑。

不同因素對提取凈化效果的影響。本研究比較了樣品量、提取溶劑、鹽析除水劑種類及分散固相吸附劑種類和比例對樣品凈化效果的影響，確定了合適的取樣量、最佳提取溶劑、除水劑和吸附劑用量。結(jié)果顯示：對于新鮮果蔬樣品，取樣量與提取溶劑的比例為1 ∶2較為合適；因使用 LC-MS/MS 檢測技術(shù)，沒必要把水除盡，所以鹽析除水劑只選擇氯化鈉，未加無水硫酸鎂，且含少量水分有利于提高部分農(nóng)藥的回收率，也會改善農(nóng)藥的色譜峰形；最終確定了2 mL的提取液選擇NH2+C18+GCB組合凈化劑，用量比例為 50 mg ∶50 mg ∶10 mg，能得到更為滿意的凈化效果。

與傳統(tǒng)的QuEChERS方法相比，鹽析選擇更為廉價的氯化鈉，固體吸附劑選擇NH2+C18+GCB組合代替PSA，凈化效果更好，成本更低。

常用的固相吸附劑有伯仲胺（PSA）、氨基粉（NH2）、C18、石墨化炭黑（GCB）等。PSA是一種弱陰離子交換吸附劑，能通過形成氫鍵去除脂肪酸、糖及其他基質(zhì)共萃取物。PSA和NH2有相同的吸附原理，由于PSA同時存在伯胺、仲胺而具有更高的去雜質(zhì)能力，等量的PSA比等量的NH2能去除更多的基質(zhì)共萃取物。但因PSA的結(jié)構(gòu)對含羧酸基團、含氟、含氯物質(zhì)有保留，因此這些目標(biāo)分析物的回收率會偏低。石墨化炭黑是炭黑在惰性氣體的保護下加熱到2 700 ℃左右生成的一種炭材料。在高溫條件下，炭黑內(nèi)部和表面的大孔隙結(jié)構(gòu)被破壞，表面生成光滑、無孔的石墨晶型結(jié)構(gòu)[7]。有研究表明GCB能夠很好地去除色素和固醇類雜質(zhì)[8]。endprint

通過所建立的檢測新方法，77種農(nóng)藥在胡蘿卜、甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、辣椒、番茄和豇豆8種蔬菜中的平均回收率在77.4%～100.7%之間，RSD在6.7%～12.4%之間，從所選蔬菜的代表性考慮，該方法在農(nóng)藥殘留定量分析中有很好的推廣前景。

從所建立的檢測方法的操作過程看，該方法簡便、快速、安全、成本低廉、重現(xiàn)性良好，具有一次處理樣品可同時測定多種農(nóng)藥殘留的特點，適合于不同種類蔬菜中多類農(nóng)藥殘留的高通量定量檢測。

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通過所建立的檢測新方法，77種農(nóng)藥在胡蘿卜、甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、辣椒、番茄和豇豆8種蔬菜中的平均回收率在77.4%～100.7%之間，RSD在6.7%～12.4%之間，從所選蔬菜的代表性考慮，該方法在農(nóng)藥殘留定量分析中有很好的推廣前景。

從所建立的檢測方法的操作過程看，該方法簡便、快速、安全、成本低廉、重現(xiàn)性良好，具有一次處理樣品可同時測定多種農(nóng)藥殘留的特點，適合于不同種類蔬菜中多類農(nóng)藥殘留的高通量定量檢測。

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通過所建立的檢測新方法，77種農(nóng)藥在胡蘿卜、甘藍、油菜、芹菜、莖用萵苣、辣椒、番茄和豇豆8種蔬菜中的平均回收率在77.4%～100.7%之間，RSD在6.7%～12.4%之間，從所選蔬菜的代表性考慮，該方法在農(nóng)藥殘留定量分析中有很好的推廣前景。

從所建立的檢測方法的操作過程看，該方法簡便、快速、安全、成本低廉、重現(xiàn)性良好，具有一次處理樣品可同時測定多種農(nóng)藥殘留的特點，適合于不同種類蔬菜中多類農(nóng)藥殘留的高通量定量檢測。

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