曹毅等

摘要：為篩選對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）具有拮抗活性的放線菌，以烤煙Coker 176、K326為材料，采用生物活性測試和半葉枯斑法，測定47株放線菌菌株發(fā)酵上清液抗TMV的活性，對具活性的菌株進行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，6株放線菌的發(fā)酵上清液具有一定的抗TMV活性，其中菌株F187、F349、F417發(fā)酵上清液對TMV具有明顯鈍化作用，發(fā)酵上清液與TMV作用30 min后抑制率分別為57.18%、60.27%、70.19%；分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株F187、F417、F349均屬鏈霉菌；鏈霉菌F187、F349、F417的代謝產(chǎn)物對TMV有較高的抑制活性，值得在菌種鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、活性物質(zhì)的分離與鑒定等方面進行深入研究。

關(guān)鍵詞：煙草普通花葉病毒（TMV）；放線菌；抗病毒活性；分子鑒定

中圖分類號： Q435.72 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0100-03

收稿日期：2013-11-12

基金項目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號：黔科合J字[2012]2257號、黔科合J字[2011]2336號）。

作者簡介：曹毅（1982—），男，云南會澤人，碩士，助理研究員，從事微生物和植物保護研究。E-mail：yicao1001@163.com。煙草普通花葉病毒?。╰obacco mosaic virus，TMV）嚴重威脅煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，給煙草生產(chǎn)和煙草種植者造成了嚴重的經(jīng)濟損失。由于植物病毒對寄主細胞的絕對寄生性、植物缺乏完整的免疫系統(tǒng)以及病毒傳播方式的多樣性，目前尚無有效的防治措施和藥劑。由煙草病毒病造成的經(jīng)濟損失已超過真菌引起的病害，成為煙草生產(chǎn)上威脅最大的一類病害[1]。長期以來，人們使用有機或無機化合物進行植株病毒病防治，不僅防效甚微[2]，也容易帶來農(nóng)藥污染。安全可靠、環(huán)境友好的生物源農(nóng)藥成為病毒防治藥劑的研究熱點。與植物源、動物源農(nóng)藥相比，微生物源農(nóng)藥具有資源豐富、成本低、效果穩(wěn)定和易商品化等特點[3-4]，是公認的無公害農(nóng)藥。近年來國內(nèi)外大量研究表明，許多細菌[5]、真菌[6]和大型真菌[7]的代謝產(chǎn)物具有良好的抗植物病毒活性，為防治植物病毒病開辟了新的途徑。

放線菌是一類極具經(jīng)濟價值和廣泛應(yīng)用前景的微生物資源，因其豐富的代謝產(chǎn)物，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。放線菌來源的抗病毒活性物質(zhì)如寧南霉素（ningnanmycin）、嘧肽霉素（cytosinpeptidemycin）、全霉素（holomycin）等對植物病毒病具有一定的治療效果[5]。由于病毒侵染危害植物的作用機理復(fù)雜以及植物病毒學(xué)研究方法受到一些因素制約等原因，其研究開發(fā)還處于初級階段，目前我國登記生產(chǎn)的微生物源抗植物病毒劑還很少。因此，不斷挖掘有生物活性的放線菌資源，開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)、對環(huán)境友好且高效的抗病毒劑，具有重要的社會、生態(tài)和經(jīng)濟意義[8]。

本研究對前期從云南、貴州、河南等全國主要植煙區(qū)健康煙草根際土壤分離純化的放線菌進行發(fā)酵產(chǎn)物抗病毒活性篩選，通過16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析對具有抗病毒活性的菌株進行分類地位的確定，以期為抗病毒放線菌資源的篩選和綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1放線菌菌株供試的47株放線菌均采集、分離自田間健康煙草根際土壤。

1.1.2烤煙品種TMV枯斑寄主煙草Coker 176、系統(tǒng)侵染寄主煙草K326，由貴州省煙草科學(xué)研究院良種繁育中心提供。

1.1.3供試毒源供試病毒為純化的TMV，試驗前繁殖保存于煙草K326。

1.1.4培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KH2PO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌 20 min 后備用。

黃豆粉培養(yǎng)基：黃豆粉 25 g、酵母浸膏 5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨2 g、可溶性淀粉 10 g、CaCO3 0.5 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.2，121 ℃ 滅菌 30 min。

1.1.5主要試劑16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit、DL2000 DNA Marker、Premix Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備供試菌株接種于高氏1號培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)4 d，用直徑5 mm的打孔器打取菌株生長良好的菌餅，接種于裝有100 mL高氏1號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶6塊；28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d后，無菌條件下吸取發(fā)酵產(chǎn)物于滅菌離心管中8 000 r/min離心15 min，收集菌株發(fā)酵上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2寄主培養(yǎng)和病毒接種供試煙草按常規(guī)育苗規(guī)程進行培育管理，7～8張葉時用于病毒接種。取新鮮感染TMV的病葉置于滅菌研缽中加適量金剛砂研磨勻漿，加入0.01 mol/L pH值7.2的磷酸緩沖液，離心后取上清液，配制40倍液的病毒汁液（40 mL/g病葉）。接種前噴灑適量金剛砂于葉片表面，用配置的病毒汁液進行常規(guī)摩擦接種，接種2 min后用清水噴霧沖洗葉面，于25 ℃無蟲溫室內(nèi)進行。

1.2.3抗TMV活性菌株的篩選初篩：取長勢一致的K326每2株分為1組，病毒汁液摩擦接種后，分別在接種后的第2、4、6 天噴灑20%的待測放線菌發(fā)酵上清液，設(shè)置陰性空白對照（病毒接種后噴灑20%的未接菌發(fā)酵培養(yǎng)液）、陽性發(fā)病對照（病毒接種后噴灑滅菌蒸餾水）。第10天開始觀察記錄發(fā)病情況，每組2株的心葉脈明、輕微花葉，或上部不超過 1/3 葉片花葉以及2株中只有1株出現(xiàn)1/3～1/2葉片花葉或少許變形或主側(cè)脈壞死，植株矮化為正常株高的2/3以上的記錄菌株號，保留備用。2株都出現(xiàn)1/2～2/3葉片花葉或變形或主側(cè)脈壞死或全株葉片花葉或嚴重變形或壞死，病株明顯矮化的則放棄。

復(fù)篩：將初篩保留的菌株發(fā)酵液與等量TMV病葉汁液混合，室溫放置30 min后，以發(fā)酵培養(yǎng)基與病毒汁液混合為陽性對照，采用半葉枯斑法[9]接種4～5葉期的TMV枯斑寄主烤煙Coker 176，左半葉接種對照，右半葉接種經(jīng)發(fā)酵液處理的TMV病葉汁液。每個處理4～5張葉，重復(fù)3次。接種5～7 d后記錄枯斑數(shù)，計算病毒抑制率：

抑制率=（對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù)）/對照枯斑數(shù)×100%。

1.2.4活性菌株的分子鑒定對具有抗TMV活性的菌株進行分子生物學(xué)鑒定，菌株基因組DNA的小量提取參照Li等的方法[10]進行。PCR引物為細菌16S rRNA序列通用引物（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），參照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京諾賽基因組中心有限公司進行測序。

1.2.5菌株系統(tǒng)發(fā)育分析通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)y定的序列與GenBank中的序列比較，從GenBank中獲取和試驗菌株相近種的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建進化樹[11]。

2結(jié)果與分析

2.1抗TMV放線菌的篩選

將前期分離保存的47株放線菌活化后進行搖瓶發(fā)酵，收集47份發(fā)酵正常、無雜菌污染發(fā)酵上清液分別進行初篩試驗，結(jié)果表明：大部分放線菌發(fā)酵上清液無抗TMV作用，噴灑后的植株第10天逐漸表現(xiàn)葉脈間褪綠、葉片畸變、嚴重系統(tǒng)花葉至葉片壞死或矮化、或死亡，而其中6株放線菌發(fā)酵上清液處理植株未出現(xiàn)發(fā)病癥狀或僅表現(xiàn)較輕微的斑駁或系統(tǒng)花葉，具有一定的抗病毒TMV作用。將初篩的6株放線菌發(fā)酵上清液在Coker 176上進行半葉枯斑法復(fù)篩驗證，枯斑抑制率的結(jié)果見表1。從表1可以看出，菌株F187、F349、F417發(fā)酵上清液對TMV具有明顯鈍化作用，發(fā)酵上清液與TMV作用30 min后，抑制率分別為57.18%、60.27%、70.19%，菌株F370、F350-2、F251的抑制作用相對較差。

3結(jié)論與討論

由TMV導(dǎo)致的煙草花葉病毒是煙草生產(chǎn)中的一類主要病害[12]，其在病葉殘體和土壤中可以存活數(shù)年，有很強的抗逆性。據(jù)調(diào)查，貴州移栽期煙苗的TMV平均帶毒率可達202%[13]，可見其對貴州省煙草生產(chǎn)具有較大的潛在危害。從微生物資源中篩選抗植物病毒病物質(zhì)已成為病毒病防治研究的熱點，利用放線菌的抗病毒活性物制備新農(nóng)藥是未來無

公害農(nóng)藥的主要發(fā)展方向[13]。目前人們已發(fā)現(xiàn)鏈霉菌中多個種如諾爾斯鏈霉菌西昌變種（Strepcomces noursei var. xichangensis）、不吸水鏈霉菌遼寧變種（Streptomyces ahygroscopicus var. Liaoningensis）等放線菌產(chǎn)生的抗生素及非抗生素類物質(zhì)對植物病毒病具有一定的治療效果[14-15]。本研究中的放線菌均采集、分離自煙草根際土壤，煙草根際特有的環(huán)境可能使得菌株具有獨特的代謝方式而產(chǎn)生具有特殊活性的代謝產(chǎn)物。本研究篩選的3株放線菌發(fā)酵上清液表現(xiàn)了明顯的體外抗TMV活性，具有進一步研究和開發(fā)的價值。

本研究的主要目的在于篩選具有抗TMV活性的放線菌，筆者只對菌株發(fā)酵上清液的抗TMV活性進行了初步研究，其菌體是否具有活性還未研究；研究中采用了適合大多數(shù)放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行發(fā)酵，而培養(yǎng)基種類及成分、放線菌菌齡、接種量、搖培時間及轉(zhuǎn)速等對發(fā)酵液活性都有一定影響，今后可對活性放線菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，對活性物質(zhì)的種類開展深入研究，同時結(jié)合基因工程菌的手段和方法，進一步挖掘、探索其在抗植物病毒上的開發(fā)應(yīng)用潛力。

致謝：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)李應(yīng)萍同學(xué)參加了病毒接種和枯斑數(shù)統(tǒng)計工作，在此一并致謝。

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