王瑩　袁英

摘要：以含不與除草甘膦結(jié)合的突變型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因除草劑篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米為材料，通過葉片噴霧和葉片離體平板培養(yǎng)等試驗(yàn)，建立快速非分子生物學(xué)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定方法。結(jié)果表明：用5 000 mg/L草甘膦葉片噴霧和用70 mg/L草甘膦葉片離體培養(yǎng)可快速準(zhǔn)確地鑒定是否轉(zhuǎn)入除草劑基因。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米；抗除草劑；草甘膦；鑒定方法

中圖分類號： S513.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0054-03

收稿日期：2013-08-15

基金項(xiàng)目：吉林省財政廳育種項(xiàng)目。

作者簡介：王瑩 （1982—），女，吉林長春人，碩士，講師，從事生物技術(shù)方向研究。Tel：（0431）84602461；E-mail：grammy1981@163.com。

通信作者：袁英，碩士，研究員，從事作物遺傳轉(zhuǎn)化研究。Tel：（0431）87063098；E-mail：32854085@qq.com。隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種植面積從1996年的170萬hm2增加到2012年的1.7億hm2，增長了99倍，這是前所未有的突破，其中抗除草劑作物種植面積最大[1]。在植物轉(zhuǎn)基因研究過程中，通常采用選擇性標(biāo)記基因提高篩選效率，而除草劑基因是較常用的篩選標(biāo)記基因，而5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因最常用。目前，國際上種植面積最大的抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米是轉(zhuǎn)EPSPS基因抗農(nóng)達(dá)除草劑玉米[2]。近幾年，國內(nèi)對抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米和抗除草劑篩選方法的研究也取得了很大的成功[3-11]。在轉(zhuǎn)基因研究和安全評價等過程中對轉(zhuǎn)基因植株的鑒定是必不可少的環(huán)節(jié)[12]，傳統(tǒng)上初步鑒定轉(zhuǎn)基因的方法是利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）鑒定目的基因DNA片段是否存在；但是PCR方法步驟繁瑣，做大量鑒定運(yùn)用時有一定的局限性。利用篩選標(biāo)記基因的農(nóng)藝性狀，建立快速有效的非生物鑒定方法非常必要。本研究以抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米為研究材料，通過葉片噴霧、葉片離體培養(yǎng)方法建立抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米快速的鑒定方法，并探索出可以有效區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株的篩選劑濃度。本研究建立的2種檢測方法既可用于轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代的檢測篩選，又可用于轉(zhuǎn)基因后代植株的大規(guī)模檢測，大大減少了轉(zhuǎn)基因后代培養(yǎng)和進(jìn)一步鑒定的工作量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料本研究所用的植株材料列于表1。

1.1.2試劑 41% 草甘膦異丙胺鹽水劑，由美國孟山都公司生產(chǎn)；6-芐氨基嘌呤 （6-BA），購于Sigma公司；國產(chǎn)瓊脂，由上海鼎國生物技術(shù)有限公司提供；EPSPS試紙條購于美國恩沃勞格公司。

1.1.3篩選培養(yǎng)基（液）的制備葉片噴霧液：50 mL滅菌水中加入1滴吐溫20，再加入不同濃度的除草劑。離體培養(yǎng)篩選培養(yǎng)基：0.7%瓊脂、1mg/L6-BA，煮沸使瓊脂溶解，冷卻

1.2方法

1.2.1葉片噴霧法篩選轉(zhuǎn)基因植株將0、1 000、3 000、5 000、7 000 mg/L草甘膦溶液均勻地噴灑在4葉期轉(zhuǎn)基因玉米和對照材料的葉片表面，直到葉片滴水為止，8～10 d后觀察。

1.2.2葉片離體培養(yǎng)法篩選轉(zhuǎn)基因植株剪取4葉期新長出5 d左右的新鮮綠色葉片（兩端均留有切口），長度約為1 cm，平貼在含有0、10、30、50、70、90 mg/L草甘膦固體培養(yǎng)基上（完全接觸培養(yǎng)基），25 ℃，16 h光照/8 h培養(yǎng)2～10 d，觀察。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株試紙條檢測試紙條快速檢測法：取稍許長度約為1 cm的葉片，放入1.5 mL 的離心管中，用研磨棒將葉片研碎，加入 0.5 mL 提取液，攪拌均勻，將試紙條按規(guī)定的方向插入混合液中，5 min后觀察結(jié)果。若試紙條出現(xiàn)2條帶，就表明該植株是陽性植株；若出現(xiàn)1條帶，說明是陰性植株；如果沒有帶，表明操作有誤[16]。

2結(jié)果與分析

2.1葉片噴灑除草劑法鑒定轉(zhuǎn)基因植株

植物葉片噴灑除草劑后，野生型植物葉片會發(fā)生枯萎，而抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物則正常生長，說明該方法可用于鑒定含抗除草劑基因的轉(zhuǎn)基因植株。

含 CP4-EPSPS基因的玉米Mo17 EPS和吉853 EPS對除草劑草甘膦具有抗性。草甘膦噴灑的濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，噴灑草甘膦即可在較短的時間內(nèi)顯著區(qū)分玉米Mo17和吉853植株是否含有CP4-EPSPS基因。噴灑草甘膦8～ 10 d 后，當(dāng)草甘膦濃度大于5 000 mg/L時，野生型玉米葉片植株整株枯萎死亡，有明顯中毒癥狀，而含CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米沒有任何枯萎癥狀（圖1），表明用該濃度的除草劑草甘膦噴灑玉米葉片可快速區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米是否攜帶CP4-EPSPS 基因。并且含CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米在高濃度草甘膦下依然能正常生長，表現(xiàn)出對草甘膦良好的耐受性。

2.2葉片離體培養(yǎng)法鑒定轉(zhuǎn)基因植株

用含除草劑的水溶液浸泡植株葉片，可簡便地鑒定轉(zhuǎn)基因植株。但由于植株葉片有較大的表面張力，影響了篩選劑與葉片的接觸。而在瓊脂培養(yǎng)基上，葉片可以完全接觸含有篩選劑的培養(yǎng)基，因此配置了含不同濃度除草劑的瓊脂培養(yǎng)基用于葉片抗性篩選劑的鑒定。由于培養(yǎng)基中不含糖分，可有效地避免離體葉片上滋生細(xì)菌和真菌。為了保持葉片的鮮綠，筆者還在培養(yǎng)基中加入了1 mg/L 6-BA。

隨著草甘膦濃度的增加，野生型植株葉片逐漸出現(xiàn)褐色現(xiàn)象。對于玉米材料吉853而言，當(dāng)培養(yǎng)基中草甘膦濃度大于50 mg/L時，野生型葉片全部褐化；而對于Mo17而言，培養(yǎng)基中草甘膦濃度大于70mg/L時，野生型葉片大部分褐化。而轉(zhuǎn)基因材料植株葉片沒有明顯的褐化癥狀，保持鮮綠色（圖2）。因此，含有70 mg/L草甘膦的固體培養(yǎng)平板即可快速鑒定玉米植株是否攜帶CP4-EPSPS基因。

2.3轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉(zhuǎn)基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結(jié)果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

隨著轉(zhuǎn)基因玉米種植面積的日益擴(kuò)大，建立標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費(fèi)時費(fèi)力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉(zhuǎn)基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域及轉(zhuǎn)基因安全檢測工作中具有很好的應(yīng)用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代的檢測，又可用于轉(zhuǎn)基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農(nóng)藥，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物是世界上種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉(zhuǎn)基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米在草甘膦濃度達(dá)到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉(zhuǎn)基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉(zhuǎn)基因植物水稻的經(jīng)驗(yàn)[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株采用試紙條檢測，結(jié)果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因，而且方法簡單、快速、準(zhǔn)確，特別適合于轉(zhuǎn)基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應(yīng)不靈敏，易造成結(jié)果誤判，應(yīng)選取幼嫩葉片進(jìn)行試驗(yàn)。在實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因后代檢測中具有一定的實(shí)用價值，為今后轉(zhuǎn)基因作物育種篩選提供了技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

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2.3轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉(zhuǎn)基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結(jié)果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

隨著轉(zhuǎn)基因玉米種植面積的日益擴(kuò)大，建立標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費(fèi)時費(fèi)力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉(zhuǎn)基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域及轉(zhuǎn)基因安全檢測工作中具有很好的應(yīng)用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代的檢測，又可用于轉(zhuǎn)基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農(nóng)藥，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物是世界上種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉(zhuǎn)基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米在草甘膦濃度達(dá)到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉(zhuǎn)基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉(zhuǎn)基因植物水稻的經(jīng)驗(yàn)[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株采用試紙條檢測，結(jié)果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因，而且方法簡單、快速、準(zhǔn)確，特別適合于轉(zhuǎn)基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應(yīng)不靈敏，易造成結(jié)果誤判，應(yīng)選取幼嫩葉片進(jìn)行試驗(yàn)。在實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因后代檢測中具有一定的實(shí)用價值，為今后轉(zhuǎn)基因作物育種篩選提供了技術(shù)支撐。

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[16]盧濤，李紅艷，章潔瓊，等. 以bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大豆的獲得及鑒定[J]. 大豆科學(xué)，2011，30（6）：895-900.

2.3轉(zhuǎn)基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉(zhuǎn)基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結(jié)果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

隨著轉(zhuǎn)基因玉米種植面積的日益擴(kuò)大，建立標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費(fèi)時費(fèi)力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉(zhuǎn)基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域及轉(zhuǎn)基因安全檢測工作中具有很好的應(yīng)用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代的檢測，又可用于轉(zhuǎn)基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農(nóng)藥，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物是世界上種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉(zhuǎn)基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米在草甘膦濃度達(dá)到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉(zhuǎn)基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉(zhuǎn)基因植物水稻的經(jīng)驗(yàn)[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉(zhuǎn)基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達(dá)后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株采用試紙條檢測，結(jié)果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因，而且方法簡單、快速、準(zhǔn)確，特別適合于轉(zhuǎn)基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應(yīng)不靈敏，易造成結(jié)果誤判，應(yīng)選取幼嫩葉片進(jìn)行試驗(yàn)。在實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因后代檢測中具有一定的實(shí)用價值，為今后轉(zhuǎn)基因作物育種篩選提供了技術(shù)支撐。

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