薛吉星等

摘 要 設(shè)計了一種罐內(nèi)快速過濾取樣探頭，以解決在線測量發(fā)酵參數(shù)過程中的發(fā)酵液連續(xù)取樣問題。此探頭由支撐體、旋塞閥、O型圈、過濾膜管、管蓋組成，可以直接插入發(fā)酵罐內(nèi)，能夠承受發(fā)酵前期的滅菌高溫，并能避免取樣時雜菌入侵發(fā)酵液。過濾膜采用筒狀陶瓷膜，罐內(nèi)發(fā)酵液經(jīng)錯流過濾，可由蠕動泵抽取適量無菌的滲透液給分析儀。利用此裝置對葡萄糖溶液進(jìn)行了取樣測試，結(jié)果表明，此裝置適用于發(fā)酵液在線取樣，取樣速率為

關(guān)鍵詞 發(fā)酵過程； 在線測量； 取樣探頭； 葡萄糖

1 引 言

為實現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化和控制，開發(fā)適用于該過程的新型傳感器和在線檢測技術(shù)十分關(guān)鍵[1]。例如，葡萄糖生物傳感器是實現(xiàn)發(fā)酵液中葡萄糖濃度實時在線檢測的主要手段。生物傳感器工作時需要有生物活性物質(zhì)的參與，這些活性物質(zhì)不能經(jīng)受高溫滅菌等無菌化處理。因此，如果沒有特殊裝置，生物傳感器不能直接連接反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵液的在線測量，這是限制生物傳感器在線應(yīng)用的主要技術(shù)障礙。目前，葡萄糖濃度檢測主要采用離線方式，實現(xiàn)在線測定或聯(lián)機測定主要有兩種技術(shù)手段：原位測定和引流測定。原位測定將酶電極直接插入生物反應(yīng)器，其優(yōu)點是無時間延遲，無樣品損耗，儀器成本低，但傳感器極易受發(fā)酵液理化因素干擾[2]，而且固定化酶無法經(jīng)受高溫滅菌。引流測定技術(shù)是目前研究的熱點。

近20年來，已有多人設(shè)計過發(fā)酵液在線引流取樣裝置，并嘗試進(jìn)行在線檢測，都存在一些問題。如張先恩等[3]設(shè)計了盤式膜透析分離取樣裝置，采用醋酸纖維素濾膜透析法，由于受到透析膜兩邊壓差、液體停留時間、溫度等因素影響，不利于在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。同樣是透析原理的TRACE Analytics GmbH生產(chǎn)的透析探頭要穩(wěn)定一些，但仍然存在類似問題。 van de Merbel在做在線檢測發(fā)酵液的嘗試時，采用發(fā)酵罐外過濾取樣系統(tǒng)[4]，其需要多路回流，系統(tǒng)復(fù)雜，且在發(fā)酵罐外，不利于滅菌。楊海麟等[5]研制一套生物反應(yīng)過程在線檢測系統(tǒng)，其取樣裝置采用膜過濾，其取樣速率過低（小于1 mL/min），若分析儀對樣品量要求較高，則不易滿足；與其類似的還有Flownamics公司開發(fā)的FISP系列取樣探頭和TRACE Analytics GmbH生產(chǎn)的過濾探頭，兩者價格昂貴，取樣速率亦過低。本研究組設(shè)計了一種透析取樣裝置，并用于發(fā)酵過程葡萄糖在線檢測系統(tǒng)[6]，實驗過程中亦發(fā)現(xiàn)葡萄糖通透性受溫度、壓差等因素干擾，不利于實際測量。

本研究設(shè)計了一種結(jié)構(gòu)簡單，牢固耐用的陶瓷膜取樣探頭，用此探頭進(jìn)行了發(fā)酵液的取樣測試，并對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

2 實驗部分

2.1 過濾取樣裝置的設(shè)計

2.1.1 工作原理 引流測定是在發(fā)酵過程中將少許發(fā)酵液引出發(fā)酵罐，在罐外用酶電極、色譜法或光譜法等[7]進(jìn)行測定。如果葡萄糖分析儀采用生物傳感器，則生物傳感器不需要放在發(fā)酵罐內(nèi)，避免了高溫滅菌對生物傳感器的破壞。為了防止在發(fā)酵過程中發(fā)酵液染菌，需要有膜隔離措施。常見的取樣方法有透析法、過濾法、電萃取法、膜萃取法等[8]，其中只有前兩種比較適用于發(fā)酵過程。透析取樣是將發(fā)酵液中的葡萄糖分子通過透析膜擴(kuò)散入存有緩沖液的擴(kuò)散池內(nèi)，然后將擴(kuò)散池內(nèi)含有葡萄糖的緩沖液引流出發(fā)酵罐進(jìn)行測試。透析取樣的透過率受透析膜兩邊壓差、緩沖液停留時間、溫度等因素影響[3，4]，難以確定葡萄糖在得到的樣品中的稀釋程度，不利于準(zhǔn)確測量。過濾取樣，采用錯流過濾技術(shù)，利用膜件實現(xiàn)發(fā)酵液與細(xì)胞的分離，同時將分離后的液體樣品引出發(fā)酵罐進(jìn)行分析檢測。

2.2.2 裝置結(jié)構(gòu) 設(shè)計的用于發(fā)酵過程在線檢測的發(fā)酵液快速過濾取樣裝置包括支撐體、旋塞閥、O型圈、過濾膜管、管蓋，其中支撐體和管蓋用螺紋結(jié)構(gòu)連接，兩者共同固定了過濾膜管，零件間采用密封膠密封；旋塞閥通過卡套連接支撐體的出液口，O型圈卡在支撐體相應(yīng)的O型圈溝槽中。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。支撐體采用不銹鋼制作，可直接安裝在發(fā)酵罐上，其與發(fā)酵罐之間由O型圈密封。支撐體中心有導(dǎo)流孔，濾出液可以由此流出該裝置，經(jīng)過旋塞閥進(jìn)入測量分析儀器。使用時，先將支撐體固定在發(fā)酵罐上，然后連接旋塞閥。過濾膜管為圓管狀，套在支撐體較細(xì)一端的圓柱體外，兩者之間存在薄的縫隙。工作時，發(fā)酵液在過濾膜管的外邊流動，經(jīng)錯流過濾滲透進(jìn)縫隙中，然后流入支撐體中心的導(dǎo)流孔。過濾膜管可采用耐高溫、孔徑0.1～0.2 μm的陶瓷膜材料，發(fā)酵液經(jīng)過過濾膜管的過濾，分離出了罐內(nèi)微生物和固體顆粒，但過濾液和發(fā)酵液中葡萄糖、無機鹽等物質(zhì)的濃度是一致的。同時，過濾膜管也阻斷了發(fā)酵罐外部的細(xì)菌等微生物通過取樣口進(jìn)入發(fā)酵罐里的發(fā)酵液中，達(dá)到防止染菌的目的。管蓋采用不銹鋼制作，通過螺紋連接支撐體。使用本裝置時，可以安裝在發(fā)酵罐上，取樣口直接連接分析儀器的進(jìn)樣口（儀器內(nèi)有泵裝置），取樣速率由分析儀控制，也可以進(jìn)行離線取樣。取樣裝置僅有5個零部件，其中支撐體和管蓋的結(jié)構(gòu)簡單，易于加工和批量化生產(chǎn)，其余零件均為標(biāo)準(zhǔn)件或可以直接購買選取，且價格低廉。因此裝置整體結(jié)構(gòu)簡單，易于裝配和批量化生產(chǎn)，制作成本低。過濾膜管卡在支撐體與管蓋之間，又有密封膠粘緊密封，這樣的結(jié)構(gòu)確保裝置整體牢固。過濾膜管可采用陶瓷膜，密封膠可采用耐高溫的環(huán)氧樹脂結(jié)構(gòu)膠，選材能夠方便地達(dá)到耐高溫、耐腐蝕的要求，可以經(jīng)受高溫高壓滅菌。過濾膜管套在支撐體外，過濾的有效面積較大，保證了在同樣壓力下，可以達(dá)到較高的取樣速度，當(dāng)要求一定的取樣速率時，由分析儀根據(jù)需要調(diào)節(jié)蠕動泵即可。采用的過濾膜可以有效防止取樣時染菌，目前陶瓷膜孔徑可低于0.1 μm。

2.2 材料與儀器

由山東省科學(xué)院生物研究所SBA系列分析儀專用緩沖劑添加蒸餾水配制的檢測用緩沖液。由市售分析純葡萄糖配制并在室溫下靜置6 h的葡萄糖溶液。工業(yè)現(xiàn)場大腸桿菌發(fā)酵液樣品，在發(fā)酵期間臨時采集并水浴滅活。

OEMBJ6001型蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。過濾取樣裝置由本實驗組設(shè)計加工，過濾膜管采用凈易CM011775型濾芯（廣州凈易環(huán)?？萍加邢薰荆?，支撐體和管蓋由不銹鋼加工，O型圈等零件為標(biāo)準(zhǔn)件，密封膠采用7102型耐高溫環(huán)氧樹脂結(jié)構(gòu)膠，引流管采用特氟龍材料。SBA40E葡萄糖生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）。

3 結(jié)果與討論

3.1 取樣速率測試

分析儀對樣品的取樣量有限定，在單位時間內(nèi)通過該裝置獲取的樣品量即為取樣速率。取樣速率與濾膜的通透性和液體的粘度、濃度及膜兩邊的壓差等有關(guān)。在測試取樣速率時，分別選用發(fā)酵液和不同濃度的葡萄糖溶液在不同的蠕動泵轉(zhuǎn)速下測試裝配取樣探頭時的取樣速率

3.4 過濾取樣裝置的特點

從取樣速率測試的結(jié)果可知，蠕動泵在不同轉(zhuǎn)速時，取樣速率會隨之線性變化，無論是否連接取樣探頭，或是改變葡萄糖溶液的濃度，其影響都不大。可以認(rèn)為在蠕動泵的不同轉(zhuǎn)速條件下，取樣探頭對不同濃度的葡萄糖溶液的阻礙作用均不明顯。這樣可根據(jù)需要調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速來控制檢測時的取樣速率。傳統(tǒng)透析取樣的透過率受葡萄糖濃度、溫度、停留時間等影響很大[8]，本裝置的葡萄糖透過率基本為100%，對測試的誤差的貢獻(xiàn)幾乎為零。在對隨機選取的發(fā)酵液進(jìn)行取樣測試時，雖然發(fā)酵液的組分、濃度和雜質(zhì)含量較葡萄糖溶液復(fù)雜得多，但其測試結(jié)果與葡萄糖溶液測試結(jié)果十分相似，因此可以認(rèn)為短期內(nèi)取樣速率和透過率幾乎不受溶液的組分、濃度和雜質(zhì)狀況的干擾。

在線引流測定，無論是透析取樣還是過濾取樣都會增加額外的時延，這主要是由于增加了管路，液體從發(fā)酵罐到儀器之間需要傳送時間，而透析取樣方法還需要額外的透析停留時間，以保證葡萄糖的通過率。0～1.5 min所測的結(jié)果一直為零，這段時間是引流管造成的新樣本傳送時間。3～4 min所測的結(jié)果已經(jīng)接近實際值，之所以還略小于實際值，是由于在陶瓷膜管和支撐體之間所留的空間過大，一部分空間內(nèi)殘存微量的上一時刻的液體稀釋了當(dāng)前溶液，減小陶瓷膜管和支撐體之間所留的空間，可以使這段時間縮短。不考慮引流管造成的傳送時間，則取樣探頭的延時為2 min（第1.5 min到第3.5 min）。

由于裝置所用材料均是耐高溫材料，在蒸氣滅菌環(huán)節(jié)不會被破壞。陶瓷膜的孔徑為0.1 μm，絕大多數(shù)細(xì)菌的直徑在0.5～5.0 μm之間，因此裝置能夠阻斷罐內(nèi)和罐外的菌體來往，即使在發(fā)生故障出現(xiàn)液體逆流，外界細(xì)菌也無法侵入發(fā)酵罐。探頭外有大量的流動發(fā)酵液不斷沖洗過濾膜，并且蠕動泵所帶來的壓差并不大，故濃度極化層的影響很小，可以忽略，在一定程度上避免了濾膜的阻塞。

本研究設(shè)計的快速過濾取樣裝置能很好地應(yīng)用于酶注射式葡萄糖生物傳感分析儀及其它類型的在線發(fā)酵液分析儀器，具有結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，取樣速度快，取樣時無需太大壓差的特點。此裝置取樣速率較大，并可根據(jù)需要調(diào)節(jié)，葡萄糖透過率一直穩(wěn)定在100%，時間延遲約2 min，解決了染菌等問題，適于在發(fā)酵過程在線監(jiān)控中應(yīng)用。

References

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張先恩. 生物傳感器，北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2006： 327

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張先恩， 胡偉平， 趙國強， 張治平， 張曉梅， 桂益群， 張 興， 危宏平. 生物工程學(xué)報， 1993， 9（3）： 210-215

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8 van de Merbel N C. J. Chromatogr.， 1999， 856（12）： 55-82

A Rapid Filtration Sampling Probe for Fermentation

Broth Online Measurement

GAO XueJin*， XUE JiXing， ZHANG Peng， WANG Pu

（School of Electronic Information and Control Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

Abstract An innerbioreactor rapid filtration sampling probe was designed to resolve the problems of continuous sampling the fermentation broth in online measurement the fermentation process. The probe consists of a support， a plug valve， an Oring， a filter membrane and a pipe cover. It can be inserted directly into the bioreactor withstanding hightemperature sterilization before fermentation， or preventing the bacteria's invasion during sampling. Fermentation broth in tank is crossflow filtrated by a cylindrical ceramic membrane which is used as filtration membrane， and then the sterile permeated liquid is transported to the analyzer by a peristaltic pump. The sampling experiments using this device was described for sampling glucose solution indicating it is suitable for fermentation online sampling. The sampling rate is up to 3.0 mL/min， glucose permeability maintains 100%， and the delay time caused by the probe is about 2 min.

Keywords Fermentation process； Online measurement； Sampling probe； Glucose.

（Received 10 December 2013； accepted 28 February 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.61174109）

GAO XueJin*， XUE JiXing， ZHANG Peng， WANG Pu

（School of Electronic Information and Control Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

Abstract An innerbioreactor rapid filtration sampling probe was designed to resolve the problems of continuous sampling the fermentation broth in online measurement the fermentation process. The probe consists of a support， a plug valve， an Oring， a filter membrane and a pipe cover. It can be inserted directly into the bioreactor withstanding hightemperature sterilization before fermentation， or preventing the bacteria's invasion during sampling. Fermentation broth in tank is crossflow filtrated by a cylindrical ceramic membrane which is used as filtration membrane， and then the sterile permeated liquid is transported to the analyzer by a peristaltic pump. The sampling experiments using this device was described for sampling glucose solution indicating it is suitable for fermentation online sampling. The sampling rate is up to 3.0 mL/min， glucose permeability maintains 100%， and the delay time caused by the probe is about 2 min.

Keywords Fermentation process； Online measurement； Sampling probe； Glucose.

（Received 10 December 2013； accepted 28 February 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.61174109）

GAO XueJin*， XUE JiXing， ZHANG Peng， WANG Pu

（School of Electronic Information and Control Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

Abstract An innerbioreactor rapid filtration sampling probe was designed to resolve the problems of continuous sampling the fermentation broth in online measurement the fermentation process. The probe consists of a support， a plug valve， an Oring， a filter membrane and a pipe cover. It can be inserted directly into the bioreactor withstanding hightemperature sterilization before fermentation， or preventing the bacteria's invasion during sampling. Fermentation broth in tank is crossflow filtrated by a cylindrical ceramic membrane which is used as filtration membrane， and then the sterile permeated liquid is transported to the analyzer by a peristaltic pump. The sampling experiments using this device was described for sampling glucose solution indicating it is suitable for fermentation online sampling. The sampling rate is up to 3.0 mL/min， glucose permeability maintains 100%， and the delay time caused by the probe is about 2 min.

Keywords Fermentation process； Online measurement； Sampling probe； Glucose.

（Received 10 December 2013； accepted 28 February 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.61174109）