路?！≈苷袢A　胡尚連　曹穎　盧學(xué)琴

摘要：以GenBank上登錄的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、歐芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白楊（Populus tomentosa）的22個WRKY家族抗病轉(zhuǎn)錄因子為分析對象，采用生物信息學(xué)方法對其系統(tǒng)發(fā)生樹、保守基序和蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，22個抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為2個大類群，7個亞類群。兩大類群的轉(zhuǎn)錄因子都具有基序1和2，系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群中的擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25，歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，其都具有基序9和基序12，擬南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，都具有基序18；系統(tǒng)發(fā)育樹中第四亞類群中的辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23，具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：植物；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；抗病；生物信息學(xué)

中圖分類號：S718.46；Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1191-05

植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列機制，以適應(yīng)和抵御各種生物和非生物逆境，在眾多的適應(yīng)性機制中，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在植物應(yīng)答環(huán)境信號刺激反應(yīng)過程中起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因。WRKY是近年來新發(fā)現(xiàn)的植物特有的新型鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子， 是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，因在其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守的7個氨基酸序列而得名，WRKY基因首先被克隆于甘薯[1]，隨后在約20多種植物中證實存在WRKY蛋白，并闡明了相應(yīng)的分子生物學(xué)功能[2]，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子主要與植物的抗逆性和衰老等生理過程有關(guān)。病原菌、傷害和植物激素類物質(zhì)等多種外界因素均能誘導(dǎo)WRKY基因的表達(dá)[3]。本研究以GenBank上登錄的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、歐芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白楊（Populus tomentosa）5個物種的22個WRKY家族抗病轉(zhuǎn)錄因子為材料，利用生物信息學(xué)方法研究該轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)的變異，為其他植物WRKY抗病基因克隆及其研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

數(shù)據(jù)資料來源于美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核苷酸數(shù)據(jù)庫和國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/），其中擬南芥有13種，AtWRKY40 NM_106732、 AtWRKY60 NM_128058、 AtWRKY48 NM_124329、AtWRKY25 NM_128578，對丁香假單胞菌起負(fù)調(diào)控作用[4-6]；AtWRKY18NM_119329的中度水平表達(dá)會引起PR基因表達(dá)及對丁香假單胞菌的抗性增強[7]；AtWRKY41 NM_117177具有雙重調(diào)控作用，能夠抵抗細(xì)菌和真菌病原物的重要下游基因的產(chǎn)物，抗丁香假單胞菌[8]；AtWRKY70 NM_115498，參與兩條抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控交叉點，即通過激活SA介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時又抑制JA介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控擬南芥的抗病反應(yīng)，主要對丁香假單胞菌起抗病作用[9]；AtWRKY33 NM_129404作為JA/ET介導(dǎo)途徑中的正調(diào)控子，在抗真菌病原菌方面發(fā)揮作用，如防治灰霉病[10]；AtWRKY3 NM_126385對抗腐生病原菌起正調(diào)控作用；AtWRKY4 AF425835可以抗青枯病與腐生病原菌，超表達(dá)時對假單胞菌有毒小種的抗性增強， 對軟腐病菌抗性減弱[11]；AtWRKY29 NM_118486是MAPK通路中可作為典型的WRKY基因參與擬南芥植株的抗病信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]；AtWRKY6 NM_104910可以抗細(xì)菌、病毒、卵菌和真菌[13]；AtWRKY27 AF418310抗青枯病[14]。辣椒有3種，CaWRKY-a AY391747抗煙草花葉病毒[15]；CaWRKY2 DQ402421抗丁香假單胞菌[16]；CaWRKY1 AY229992通過負(fù)調(diào)控作用抗病菌[17]。歐芹3種，PcWRKY4 AF204925、PcWRKY5 AF204926均為抗大豆疫霉菌的激發(fā)子[18]；PcWRKY1 PCU48831抗大豆疫霉菌[19]。毛白楊有1種，PtWRKY23 EF051079抗葉銹病[20]。水稻2種，OsWRKY71 AB190817參與赤霉素信號傳導(dǎo)，脫落酸介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，依賴于R基因的防衛(wèi)反應(yīng)信號途徑，抗白葉枯?。籓sWRKY13 EF143611參與茉莉酸介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、水楊酸介導(dǎo)的信號途徑，抗白葉枯病和稻瘟病。

1.2 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用Maga 5.0軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的對病原菌有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子和基因全長序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行Bootstrap校正，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子保守基序的分析

利用在線MEME 4.8.0軟件（http：//meme.sdsc.edu）對轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)分析

利用在線CPHmodels工具對9種蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，并利用高級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RasMol對各轉(zhuǎn)錄因子和基因編碼的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對22個WRKY家族抗病轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果（圖1）表明，可以將這22個抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為2大類群，7個亞類群。第一大類群中的歐芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25、AtWRKY33都含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域。擬南芥WRKY抗病轉(zhuǎn)錄因子中對腐生病原菌起正調(diào)控作用的為AtWRKY3和AtWRKY4，二者抗腐生病原菌，起正調(diào)控作用[12]。

歐芹PcWRKY1對大豆疫霉菌有抗性作用[19]，擬南芥AtWRKY33對灰霉病起抗性作用[11]，而辣椒CaWRKY-a對煙草花葉病毒起抗性作用。從系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）上可以看出，這3個轉(zhuǎn)錄因子組成第一個亞類群，其中擬南芥AtWRKY33與辣椒CaWRKY-a親緣性相近，而與歐芹PcWRKY1的親緣性次之，但目前的研究表明其在抗病原理上并不相同，有待進(jìn)一步研究。

擬南芥AtWRKY25和辣椒CaWRKY2聚為第二亞類群，二者均對丁香假單胞菌起調(diào)控作用；擬南芥AtWRKY3和AtWRKY4聚為第三亞類群，二者均對腐生病原菌起調(diào)控作用。

擬南芥AtWRKY48、毛白楊PtWRKY23和辣椒CaWRKY1聚為第四亞類群。研究表明，擬南芥AtWRKY48對丁香假單胞菌起負(fù)調(diào)控作用[5]，辣椒CaWRKY1對丁香假單胞菌、煙草花葉病毒等起負(fù)調(diào)控作用[17]，毛白楊PtWRKY23對葉銹病起抗性作用。

擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60、AtWRKY40，水稻OsWRKY71和歐芹PcWRKY4聚為第五亞類群，其中對細(xì)菌、真菌、卵菌、病毒起抗性作用的擬南芥AtWRKY6[13]單獨成一類，擬南芥AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40均對假單胞菌有抗性作用[4，7]，而擬南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71均會引起R基因表達(dá)抗病，且都是通過SA代謝途徑起到抗病作用[4]，而歐芹PcWRKY4為抗大豆疫霉菌因子。

擬南芥AtWRKY27、AtWRKY29和水稻OsWRKY13聚為第六亞類群。在抗病方面，擬南芥AtWRKY27抗青枯病，AtWRKY29是MAPK通路中能夠抵抗細(xì)菌和真菌病原物的重要下游基因的產(chǎn)物，水稻OsWRKY13參與茉莉酸介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、 水楊酸介導(dǎo)的信號途徑，抗白葉枯病和稻瘟病。

擬南芥AtWRKY41、AtWRKY70與歐芹PcWRKY5聚為第七亞類群。研究表明，它們均屬于鋅指結(jié)構(gòu)C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）型[21]，其中擬南芥AtWRKY41與AtWRKY70均對細(xì)菌具有抗病性，但抗病途徑并不相同[8，10]，而歐芹PcWRKY5對大豆疫霉菌因子有抗性，它們在抗病方面并不完全相同。

2.2 不同植物抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守基序的分析

由圖2可知，22個抗病的WRKY轉(zhuǎn)錄因子都具有保守基序1和2，部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間也有共性。系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群的1、2、3亞類群中的歐芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25和AtWRKY33都具有基序9和基序12，而第一大類群的其他亞類群和第二大類群的其他 WRKY轉(zhuǎn)錄因子都不具有基序9和基序12。

第五亞類群的擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，水稻OsWRKY71，歐芹PcWRKY4都具有基序5和基序6，而第一大類群的其他亞類群和第二大類群的其他WRKY轉(zhuǎn)錄因子都不具有基序5和基序6。第四亞類群中辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23特有的基序為基序18。第七亞類群的擬南芥AtWRKY41和AtWRKY70，歐芹PcWRKY5都具有基序17。研究表明，擬南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71通過水楊酸代謝途徑抗病[4]，基序分析表明，二者共有基序1、2、4、5、6和14。擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子中對腐生病原菌抗性起正調(diào)控作用的AtWRKY4和AtWRKY3都具有基序11和基序10。許多擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為防衛(wèi)信號的負(fù)調(diào)控因子起作用， 如AtWRKY18、AtWRKY25、AtWRKY27、AtWRKY40、AtWRKY41、AtWRKY48和AtWRKY 60，這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子都具有基序1、2、6和5。擬南芥AtWRKY70編碼的蛋白質(zhì)參與兩條抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，一是通過激活SA介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，二是抑制JA介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控擬南芥的抗病反應(yīng)[10]，其僅有基序1、2、19和20。

2.3 不同植物抗病轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)分析

高級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)生物學(xué)功能，對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析，有助于理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性[22]。由圖3可知，擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似，均屬于抗細(xì)菌型轉(zhuǎn)錄因子[6，12]。歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似，辣椒CaWRKY-a對煙草花葉病毒具有抗性作用，而歐芹PcWRKY1對大豆疫霉菌有抗性作用。水稻OsWRKY13、歐芹PcWRKY4和PcWRKY5、擬南芥AtWRKY18和AtWRKY40編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似。辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23，擬南芥AtWRKY48和AtWRKY33編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似，但其功能不盡相同[5，10]，有待進(jìn)一步研究。研究表明，擬南芥AtWRKY18和AtWRKY6，歐芹PcWRKY1以及水稻OsWRKY13的C末端結(jié)構(gòu)域可與（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）相結(jié)合，產(chǎn)生特異性作用，參與植物防衛(wèi)反應(yīng)作用[23，24]。

3 小結(jié)

通過對22個抗病WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹、基序以及蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，得出22個抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為2個大類群，7個亞類群。第一大類群由歐芹PcWRKY1、PcWRKY4，辣椒CaWRKY1、 CaWRKY-a、 CaWRKY2，擬南芥AtWRKY4、 AtWRKY3、 AtWRKY25、 AtWRKY33、AtWRKY48、AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，毛白楊PtWRKY23，水稻OsWRKY71組成。擬南芥AtWRKY41、AtWRKY70、AtWRKY27和AtWRKY29，歐芹PcWRKY5，水稻OsWRKY13組成第二大類群。22個轉(zhuǎn)錄因子都具有基序1和2，系統(tǒng)發(fā)育樹中第一大類群中的擬南芥AtWRKY4和AtWRKY25，歐芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，都具有基序9和基序12，擬南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，都具有基序18；系統(tǒng)發(fā)育樹中第四亞類群中的辣椒CaWRKY1和毛白楊PtWRKY23具有相似的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

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