倪婧　達(dá)愛斯　謝道燕　柴建萍　江秀均　黃平　羅雁婕

摘要：用不同濃度天然產(chǎn)物東莨菪內(nèi)酯處理桑葉飼喂家蠶（Bombyx mori）后，通過測(cè)定家蠶頭部乙酰膽堿酯酶（AChE）活性，研究東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶的影響。結(jié)果表明，12 h時(shí)家蠶出現(xiàn)擺頭、吐液等輕微中毒癥狀，24 h時(shí)中毒癥狀減輕，48 h時(shí)中毒癥狀消失，家蠶恢復(fù)正常；5齡第三天家蠶飼喂浸過不同濃度東莨菪內(nèi)酯的桑葉后，頭部AChE比活力變化趨勢(shì)與對(duì)照變化趨勢(shì)相反，且除了藥后24 h時(shí)的比活力高于對(duì)照外，其余時(shí)間段比活力均顯著低于對(duì)照，表現(xiàn)為抑制作用；在一定濃度范圍內(nèi)，東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系，且抑制率隨東莨菪內(nèi)酯濃度的升高而升高。5.0×10-2、

2.5×10-2 mol/L東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制率分別達(dá)到99.4%、90.6%，當(dāng)東莨菪內(nèi)酯濃度小于5.0×10-4 mol/L時(shí)，其對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制趨勢(shì)逐漸變緩，抑制中濃度IC50為4.03×10-3 mol/L。

關(guān)鍵詞：東莨菪內(nèi)酯；家蠶（Bombyx mori）；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號(hào)：S881.2； S482.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1106-03

乙酰膽堿酯酶（Acetyleholinesterase，AChE）是昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的酶系之一，在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中與乙酰膽堿受體一起參與完成神經(jīng)-神經(jīng)、神經(jīng)-肌肉突觸之間動(dòng)作電位的傳遞，其主要生理功能是催化水解陽離子性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，維持神經(jīng)沖動(dòng)正常傳遞[1]。若乙酰膽堿酯酶與殺蟲劑接觸，其活性部位與殺蟲劑不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致乙酰膽堿不能被水解，酶失活，乙酰膽堿在突觸處積累，過量的乙酰膽堿造成去極化阻斷，從而抑制正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲中毒死亡[2，3]。東莨菪內(nèi)酯（Scopoletin）又稱莨菪亭、莨菪酚、東莨菪甙元、7-羥基-6-甲氧基香豆素等，是廣泛存在于植物中的香豆素類化合物，大部分的藥用東莨菪素是從傘形科植物防風(fēng)、白云花和旋花科植物丁公藤和光葉丁公藤中提取而來[4]，是一種天然產(chǎn)物，且在桑樹的葉、根、皮中也含有此類物質(zhì)。

研究表明，有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶（AChE）有強(qiáng)烈的抑制作用[5-7]。在天然產(chǎn)物活性物質(zhì)中，AChE的酯動(dòng)部位抑制劑毒扁豆

堿 [8，9]，以其為模板合成的氨基甲酸酯類農(nóng)藥已經(jīng)成為一種農(nóng)藥生產(chǎn)上的主要?dú)⑾x劑。但東莨菪內(nèi)酯對(duì)昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性影響研究的報(bào)道較少，本研究選擇鱗翅目模式生物昆蟲家蠶（Bombyx mori）作為研究對(duì)象，通過研究東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶活體和離體乙酰膽堿酯酶活性的影響，為進(jìn)一步探討東莨菪內(nèi)酯殺蟲機(jī)理提供參考，為以后開發(fā)既不影響家蠶正常生長(zhǎng)發(fā)育又能防治桑樹害蟲的東莨菪素類植物源殺蟲劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

家蠶品種：菁松×皓月，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：東莨菪內(nèi)酯（Scopoletin），由西南大學(xué)植保學(xué)院天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究室提供；

1.6 mmol/L 碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATChI），ACROS ORGANICS公司生產(chǎn)；5，5-二硫代雙硝基苯甲酸[5，5-dithio-bis （2-nitrobenzoic acid）]（DTNB），Damas-beta公司生產(chǎn)；1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Albumin bovine serum），云科生物工程公司生產(chǎn)；考馬斯亮藍(lán)G-250，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：高速冷凍離心機(jī)、xMark酶標(biāo)儀、玻璃勻漿器。

1.3 活體抑制施藥方法

采用浸葉法，將新鮮桑葉分別浸入不同濃度（0.104、0.078、0.052、0.026 mol/L）的東莨菪內(nèi)酯藥液中，葉片全部浸濕，對(duì)照以蒸餾水浸葉，10 s后取出室溫條件下自然晾干，按正常的飼喂量飼喂5齡第三天家蠶，每個(gè)濃度3次重復(fù)，飼喂3 h后，去除未吃盡的桑葉，之后以新鮮無毒桑葉飼喂，觀察家蠶中毒癥狀，且每隔8 h取家蠶于-80 ℃冰箱保存待用，至48 h，共取樣6次。

1.4 活體抑制粗酶液制備

將所取樣品家蠶頭部剪下，0.9% NaCl生理鹽水清洗，以1：5（m：V）的比例于0.01 mol/L磷酸緩沖液（1 mmol/L EDTA，l% TritonX-100，1 mol/L NaCl，pH 8.0）冰浴，研磨成勻漿，勻漿液于4 ℃，15 000 r/min離心20 min，取上清液作為待測(cè)酶液。

1.5 蛋白質(zhì)及AChE活性測(cè)定

1.5.1 酶源蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]中的考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定酶源蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5.2 AChE活性測(cè)定 參照張瑩等[11]的酶活性測(cè)定方法，以0.8 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應(yīng)底物，0.125 mmol/L 5，5-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。取待測(cè)酶液50 ？滋L與100 ？滋L ATChI底物混勻放在40 ℃酶標(biāo)儀中保溫10 min后，加入100 ？滋L DTNB顯色劑顯色并終止反應(yīng)，在412 nm下測(cè)定光密度（OD），按（1）式計(jì)算AChE的比活力[2，12]。

AChE 比活力=■ （1）

式中，V表示反應(yīng)體系的總體積（mL）；S表示反應(yīng)體系中所加酶液體積（mL）；M表示反應(yīng)體系中AChE的實(shí)際蛋白質(zhì)含量（mg）；消光系數(shù) e=13.6；光程L=1 cm。

1.5.3 AChE離體活性測(cè)定 提取正常條件下飼養(yǎng)至5齡第三天家蠶頭部粗酶液待用，配制5.0×10-2、2.5×10-2、5.0×10-3、2.5×10-3、5.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-5、2.5×10-5 mol/L系列濃度東莨菪內(nèi)酯抑制劑（0.05 mol/L磷酸緩沖液稀釋），參照文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定AChE殘余活力，根據(jù)公式（2）計(jì)算抑制率[2，14]，每個(gè)處理設(shè)1個(gè)空白和3次重復(fù)。

抑制率 =[OD對(duì)照-（OD處理-OD空白）]/ OD對(duì)照×100% （2）

式中，OD處理指待測(cè)液中添加酶液和抑制劑；OD空白指待測(cè)液中不添加酶液，添加與處理相同濃度的東莨菪內(nèi)酯抑制劑；OD對(duì)照指待測(cè)液中添加酶液，未添加抑制劑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 13.0軟件的Probit模塊對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，求出乙酰膽堿酯酶（AChE）比活力、抑制率、得出回歸方程及IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶中毒癥狀

用東莨菪內(nèi)酯處理過的桑葉飼喂家蠶，3 h后觀察到大部分藥劑處理過的桑葉被家蠶取食，但家蠶未表現(xiàn)出中毒癥狀；移除未吃盡桑葉，之后以新鮮無毒桑葉飼喂，12 h時(shí)觀察到食下高濃度（0.104、0.078 mol/L）東莨菪內(nèi)酯處理葉片的部分家蠶出現(xiàn)擺頭現(xiàn)象，與對(duì)照相比行動(dòng)遲緩，少數(shù)靜臥在桑葉上，有輕微吐液，且取食量少于對(duì)照，食下低濃度（0.052、0.026 mol/L）處理葉片的家蠶中毒癥狀較輕；24 h時(shí)觀察到大多數(shù)家蠶中毒癥狀減輕，且取食量較12 h時(shí)增加；48 h時(shí)觀察到擺頭、吐液等中毒癥狀消失，家蠶基本恢復(fù)正常狀態(tài)，與對(duì)照相比差異不大。在整個(gè)中毒過程中沒有出現(xiàn)家蠶死亡的現(xiàn)象。

2.2 東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部AChE活性的影響

東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部AChE活性的影響如圖1所示。家蠶食下毒葉后，8 h時(shí)測(cè)得各濃度處理后的家蠶頭部AChE比活力與對(duì)照差異不大，16 h與對(duì)照相比顯著降低，且東莨菪內(nèi)酯濃度越高AChE比活力越低；24 h時(shí)各濃度處理后的AChE比活力均比16 h時(shí)升高且都高于對(duì)照；32 h時(shí)對(duì)照AChE比活力比24 h時(shí)顯著升高，但各濃度處理后的AChE比活力比24 h時(shí)降低，與對(duì)照差異較大，之后各濃度處理后的AChE比活力逐漸降低，且差異不大，但都顯著低于對(duì)照?？傮w來看，添食東莨菪內(nèi)酯處理的毒葉后，家蠶頭部AChE比活力變化趨勢(shì)與對(duì)照變化趨勢(shì)相反，說明東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部AChE活性有一定影響，且表現(xiàn)為抑制AChE活性，并隨東莨菪內(nèi)酯濃度的升高，AChE受抑制作用增強(qiáng)。

2.3 東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶離體AChE活性的影響

測(cè)定不同濃度東莨菪內(nèi)酯作用下家蠶頭部離體AChE的抑制活性，按公式（2）計(jì)算出抑制率，以抑制率對(duì)抑制劑濃度的負(fù)對(duì)數(shù)作圖，如圖2所示。東莨菪內(nèi)酯在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且對(duì)AChE活性的抑制率隨東莨菪內(nèi)酯濃度的升高而升高。5.0×10-2 、2.5×10-2 mol/L東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制率分別達(dá)到99.4%和90.6%，當(dāng)東莨菪內(nèi)酯濃度小于5.0×10-4 mol/L后，其對(duì)家蠶頭部離體AChE活性的抑制趨勢(shì)逐漸變緩。根據(jù)藥劑對(duì)AChE活性抑制的劑量-效應(yīng)關(guān)系，求出東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部離體AChE的回歸方程為y=1.689x+4.045，抑制中濃度IC50值為4.03×10-3 mol/L。

3 討論

東莨菪內(nèi)酯屬香豆素類化合物，廣泛存在于丁公藤、地骨皮、白芷、胡盧巴、黃花敗醬、桑樹等多種常見植物中，是從植物中提取的天然產(chǎn)物。在醫(yī)藥領(lǐng)域，根據(jù)公認(rèn)的病理-膽堿能缺失學(xué)說，已有大量研究表明，通過東莨菪內(nèi)酯抑制乙酰膽堿酯酶活性，降低乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿的能力，增加腦內(nèi)乙酰膽堿含量，可有效治療阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD），即老年癡呆癥[15-17]。Furey等[18]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射東莨菪堿（4 μg/kg）可以迅速減輕抑郁癥患者的抑郁程度，劉悅等[19]也研究發(fā)現(xiàn)東莨菪堿能夠有效改善網(wǎng)癮患者伴發(fā)的抑郁癥狀。通過此類相關(guān)研究可明確，乙酰膽堿酯酶不僅是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)，也是東莨菪內(nèi)酯的作用靶標(biāo)。也有研究表明，東莨菪內(nèi)酯對(duì)桑園害螨——朱砂葉螨有觸殺作用，且能顯著抑制朱砂葉螨乙酰膽堿酯酶、單胺氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，其LC30、LC50、LC90值分別為0.872、1.243、2.956 mg/mL[20]，可作為植物源殺螨劑進(jìn)一步開發(fā)利用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯在較高濃度（0.104、0.078 mog/L）時(shí)可引起家蠶輕微中毒癥狀，低濃度（0.052、0.026 mog/L）時(shí)觀察到的中毒癥狀不明顯，且中毒癥狀均在48 h后消失，家蠶恢復(fù)正常；東莨菪內(nèi)酯對(duì)家蠶頭部AChE活性表現(xiàn)出抑制作用，且抑制作用隨東莨菪內(nèi)酯濃度升高而增強(qiáng)。綜合觀察結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果，雖然高濃度東莨菪內(nèi)酯在一定程度上會(huì)引起家蠶輕微中毒，但是低濃度沒有觀察到明顯的中毒癥狀，在桑園中如果選用適當(dāng)濃度東莨菪內(nèi)酯作為植物源殺蟲劑，既能保證桑葉對(duì)家蠶的安全性，又能防治桑園害螨，為進(jìn)一步研究東莨菪內(nèi)酯在桑園害蟲防控方面奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LI F，HAN Z J. Purification and characterization of acetylcholinesterase from cotton aphid Aphis gossypii Glover）[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2002，51（1）：37-45.

[2] 彭 霞.農(nóng)藥靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶的分離純化及性質(zhì)研究[D].成都：四川大學(xué)， 2007.

[3] SHANG J Y， SHAO Y M，LANG G J，et al.Expression of two types of acetylcholinesterase gene from the silkworm， Bombyx mori， in insect cells[J].Insect Science， 2007，14（6）：443-449.

[4] 方 專，何光力，何 菱.微波輔助合成東茛菪素[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（3）：302-303.

[5] 馬 惠.農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒性評(píng)價(jià)研究[D].濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006.

[6] 陳小平，青學(xué)剛，嚴(yán)欲民，等.常用新農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒力及殘效期研究[J].四川蠶業(yè)，2005（2）：12-24.

[7] 顧 穎，王雨軒，王 斌，等.六種農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的體外毒性效應(yīng)[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境，2004，219（2）：70-73.

[8] 張赟彬，宋 慶，胡劉巖.天然產(chǎn)物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，11（1）：1-6.

[9] 邊紅玲.毒扁豆堿的結(jié)構(gòu)修飾及抗膽堿酶構(gòu)效關(guān)系的研究[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2009.

[10] BRADEFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72： 248-254.

[11] 張 瑩，黃 建，高希武，等.兩種蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶對(duì)殺蟲藥劑敏感度比較[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7（3）：221-226.

[12] 黃 曉，滕 云，陶 科，等.天然產(chǎn)物對(duì)家蠶乙酰膽堿酯酶抑制作用研究[J].四川動(dòng)物，2008，27（3）：327-330.

[13] BYRNE F J，DEVONSHIRE A L. Insensitive acetylcholinesterase and esterase polymorphism in susceptible and resistant population of the tobacco whitefly Bemisia tabaci（Genn.）[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，1993，45（1）：34-42.

[14] 殷帥文，劉麗萍，王安萍，等.15種植物不同溶劑萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的初步研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，33（4）：52-56.

[15] 鄒 壘，全明海，程永強(qiáng)，等.乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（增刊）：105.

[16] 王 錚，祝 勇.阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制與藥物治療[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2007，3（11）：83-86

[17] 楊中鐸，任 晉，薛鵬輝，等.藏藥中乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，7（2）：194-196.

[18] FUREY M L， DREVETS W C. Antidepressant efficacy of the antimuscarinic drug scopolamine： A randomized， placebo-controlled clinical trial[J]. Arch Gen Psychiatry，2006，63： 1121-1129.

[19] 劉 悅，楊國棟，姚新民.藥物干預(yù)和心理疏導(dǎo)治療網(wǎng)絡(luò)成癮綜合征40例臨床療效觀察[J].中國藥物濫用防治雜志，2007（2）：88-91.

[20] 梁 為，白雪娜，馬蘭青，等.東莨菪素對(duì)朱砂葉螨的毒力及殺螨機(jī)理初探[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（8）：68-71.