陳 蕾， 熊紅珍， 鄒 川

(1.廣東省口腔醫(yī)院牙體牙髓科，廣東 廣州 510280;2.廣東省中醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，屬于人體的正常菌群，是頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌.在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、高堿性的惡劣環(huán)境中能長(zhǎng)期生存，并形成再感染，該菌在根管治療失敗的過程中扮演著十分重要的角色［1］.此外，糞腸球菌對(duì)磺胺類、頭孢菌素低水平的氨基糖苷類等藥物具有天然的耐藥性，而且對(duì)于人們使用的抗生素，可通過接受外來(lái)耐藥基因質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，或通過基因突變來(lái)獲得耐藥性［2］.目前，根管治療中常規(guī)的機(jī)械預(yù)備和沖洗消毒方法并不能完全清除已定植于根管中的糞腸球菌.本課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方提取液:黃芩、大黃、五倍子、蛇床子對(duì)難治性慢性根尖周炎的優(yōu)勢(shì)菌群有良好的抗菌效果［3］.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討上述中藥復(fù)方以及4種單味藥對(duì)糞腸球菌超微結(jié)構(gòu)的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

菌種準(zhǔn)備和細(xì)菌培養(yǎng)將由中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院微生物室提供糞腸球菌ATCC 29212，接種于腦心浸液 (brian heart infusion，BHI)培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇培養(yǎng)48 h.培養(yǎng)至血平板上可劃出單個(gè)菌落時(shí)，用接種環(huán)挑取1個(gè)典型菌落，在載玻片上涂片、烘干，采用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌涂片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征.經(jīng)純化鑒定后［4］，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ昧姿猁}緩沖液pH=7.2配成細(xì)菌混懸液(1.0×109CFU/mL).

1.2 方法

(1)中藥復(fù)方提取液的配制 各取200 g原藥材:黃芩、大黃、五倍子、蛇床子，除去蟲垢及雜質(zhì)，沖洗清潔、干燥，粉碎后過28目篩，稱取50 g，加無(wú)離子水100 mL，室溫下浸泡24 h，過濾離心，取上清液，共兩次.上清液進(jìn)行濃縮并冷凍干燥，所得干粉視為藥材水提取物純品.黃芩、大黃、五倍子、蛇床子4種中藥干粉分別制成質(zhì)量濃度為0.2 g/mL水提液，并按1∶1∶1∶1 配制成質(zhì)量濃度為 0.2 g/mL 中藥復(fù)方提取液.

(2)菌株準(zhǔn)備和操作步驟 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)并活化鑒定后使用4℃生理鹽水對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心漂洗1～2次，800～1 500 r/min離心5 min;將洗滌干凈的菌株，用生理鹽水制備1.0×109CFU/mL細(xì)菌懸液，分裝6個(gè)試管，每管細(xì)菌10 mL，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液;實(shí)驗(yàn)管細(xì)菌沉淀中分別加入質(zhì)量濃度為0.2 g/mL中藥復(fù)方、黃芩、大黃、五倍子和蛇床子提取液各10 mL，陰性對(duì)照管細(xì)菌沉淀中加生理鹽水10 mL;搖開沉物混勻，37℃下處理15 min;在藥物處理和對(duì)照組菌液中分別加入少量血清，1 500 r/min離心5 min，使細(xì)菌黏結(jié)，棄去上清液.

用4℃生理鹽水對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心漂洗1～2次，800 ～1 500 r/min離心 5 min;使用1 500 μL Eppendorf(EP)管將漂洗好的細(xì)胞在1 500～2 000 r/min離心10 min，成肉眼可見的約0.5～1 mm高細(xì)胞團(tuán)塊，切勿超出1.5 mm，貼壁加入500 μL 4℃ 體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛，避免震蕩;于4℃冰箱靜置3 d.

(3)超薄切片制備過程 清洗:PBS緩沖液漂洗5次，每次15 min.固定:體積分?jǐn)?shù)為1%鋨酸4°C 1 h.清洗:PBS緩沖液沖洗3次，每次15 min.脫水:棄溶液，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%丙酮15 min，搖動(dòng)EP管，使容器周壁及上蓋均接觸到丙酮;棄溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為100%丙酮脫水3次，每次15 min，搖動(dòng)玻璃瓶或EP管，使容器四周及上蓋均接觸到丙酮.浸漬:棄溶液，加入V樹脂∶V丙酮=1∶1，靜置2 h;棄溶液，加入 V樹脂∶V丙酮=2∶1，靜置4 h;棄溶液，加入樹脂過夜;包埋:將的樹脂和標(biāo)本轉(zhuǎn)移到相應(yīng)包埋板中，加入標(biāo)簽，待標(biāo)本下沉至包埋板底部，放入烤箱;聚合60℃聚合，72 h;超薄切片(60～70)nm;空氣干燥過夜;染色:醋酸雙氧鈾20 min，水洗3次，每次5 min;檸檬酸鉛10 min，水洗3次，每次5 min;空氣干燥4 h以上.

(4)透射電鏡觀察 采用Hitach 7500型透射電鏡觀察糞腸球菌在中藥處理后超微結(jié)構(gòu)基本病理變化.

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌純化培養(yǎng)

糞腸球菌進(jìn)行復(fù)蘇、純培養(yǎng)后，在瓊脂平皿上呈現(xiàn)乳脂狀的白色或灰白色菌落，邊緣整齊，凸起、不透明、有光澤、表面光滑，直徑(1.0 ～2.0)mm，表現(xiàn)為α或β性溶血.經(jīng)菌落形態(tài)、菌體革蘭氏染色及生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果均符合糞腸球菌手冊(cè)鑒定特性，即呈圓形或橢圓形革蘭陽(yáng)性球菌，直徑(0.5～1.0)μm，大多數(shù)成對(duì)或短鏈狀排列，菌體周圍無(wú)鞭毛和芽孢，無(wú)運(yùn)動(dòng)特性，觸酶陰性，發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵阿拉伯糖.

2.2 中藥復(fù)方提取液和單味藥對(duì)糞腸球菌超微結(jié)構(gòu)的影響

黃芩組:胞壁較完整，胞漿稍微變性，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡較小，沒有或少量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖1).

大黃組:大部分胞壁不完整，破裂呈不連續(xù)狀態(tài)，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，胞漿內(nèi)可見大量顆粒樣黑色沉淀(圖2).

五倍子組:胞壁完整，胞漿完整，胞膜表面有短小突起，核漿比大，細(xì)胞器少，出現(xiàn)較小空泡(圖3).

蛇床子組:胞壁變薄，胞漿變性嚴(yán)重，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，有少量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖4).

中藥復(fù)方組:胞壁變薄或消失，細(xì)胞變形，出現(xiàn)裂解或自溶狀態(tài)，核漿消失，大量細(xì)胞內(nèi)容物外排(圖5).

正常對(duì)照組:胞壁完整，包漿完整，胞膜表面有短小突起，核漿比大，細(xì)胞器少(圖6).

圖1 黃芩組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.1 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix Scutellariae group(×80 000)

圖2 大黃組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.2 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Radix et Rhizoma Rhei group(×80 000)

圖3 五倍子組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.3 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Galla chinensis group(×80 000)

圖4 蛇床子組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 0000)Fig.4 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Cnidium monnieri group(×80 000)

圖5 中藥復(fù)方組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.5 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Herbal compound group(×80 000)

圖6 正常對(duì)照組糞腸球菌的超微結(jié)構(gòu)改變(×80 000)Fig.6 The ultramicrostructure changes of Enterococcus faecalis in Negative control group(×80 000)

3 討論

有研究提示，黃芩、大黃、五倍子、蛇床子對(duì)初次牙髓感染的根管中檢出率較高的牙齦卟啉單胞菌抗菌效果明顯［5］.而作為頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌，糞腸球菌可以饑餓狀態(tài)在惡劣的環(huán)境中長(zhǎng)期生存，在牙齒根管充填后的頑固性根尖周感染中常被檢出［1］.

黃芩(Radix Scutellariae)對(duì)革蘭氏陰性的細(xì)菌如牙齦卟啉單胞菌，有較強(qiáng)的抑殺作用［5］，能使菌體蛋白和酶變性、沉淀，溶解胞漿［6］.但充分發(fā)揮需要藥物穿透菌體細(xì)胞壁.對(duì)于細(xì)胞壁較厚的糞腸球菌，黃芩的抑菌效果相對(duì)較弱［7］.本研究結(jié)果顯示，透射電鏡下可見經(jīng)黃芩處理后的糞腸球菌大多數(shù)菌體細(xì)胞壁較完整，沒有或少量細(xì)胞內(nèi)容物外排，胞漿輕度變性，個(gè)別胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡.可能與黃芩苷等活性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌壁的結(jié)合作用較低，穿透糞腸球菌細(xì)胞壁的作用有限有關(guān).

中藥大黃(Radix et Rhizoma Rhei)主要成分大黃蒽醌衍生物，對(duì)各種細(xì)菌都具有明顯的抑菌作用.掃描電鏡下可見經(jīng)大黃處理后的糞腸球菌大部分胞壁不完整，破裂呈不連續(xù)狀態(tài)，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，胞漿內(nèi)可見大量顆粒樣黑色沉淀.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，大黃的抗菌特點(diǎn)為:破壞菌體的細(xì)胞壁，增強(qiáng)細(xì)胞通透性，使胞漿蛋白沉淀.與多位學(xué)者的研究結(jié)果基本一致［7-9］，大黃對(duì)糞腸球菌具有較強(qiáng)的抑殺作用，其作用機(jī)制可能是大黃素可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，抑制菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成［10］.

五倍子(Galla chinensis)水提取物通常被認(rèn)為抗菌效果較好且廣泛［11］，通過抑制細(xì)菌產(chǎn)生水不溶性胞外多糖的關(guān)鍵酶—葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性［12］，抑制菌斑胞外基質(zhì)生成［13］.本課題小組前期研究也發(fā)現(xiàn)五倍子能沉淀牙齦卟啉單胞菌的胞漿蛋白，使厭氧菌的胞漿出現(xiàn)大量顆粒樣黑色沉淀和較多空泡.但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子對(duì)糞腸球菌的抗菌效果有限，鏡下見絕大多數(shù)細(xì)胞壁、細(xì)胞漿完整，僅個(gè)別胞漿出現(xiàn)較小空泡.這可能與革蘭陽(yáng)性的糞腸球菌細(xì)胞壁較厚，五倍子滲透能力相對(duì)較弱［14］，鞣質(zhì)難以進(jìn)入胞漿發(fā)揮其收斂作用.

經(jīng)蛇床子(Cnidium monnieri)處理后的糞腸球菌胞壁變薄，胞漿變性嚴(yán)重，胞漿內(nèi)容物聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，有少量細(xì)胞內(nèi)容物外排.此外，蛇床子對(duì)水不溶性葡聚糖合成抑制超過40%，能減少細(xì)菌生物膜胞外基質(zhì)的產(chǎn)生［15］.

本研究結(jié)果顯示:中藥復(fù)方組糞腸球菌的細(xì)胞壁失去原有結(jié)構(gòu)而明顯變薄或消失，細(xì)胞變形，出現(xiàn)裂解或自溶狀態(tài)，核漿消失，大量細(xì)胞內(nèi)容物外排.提示中藥復(fù)方抗糞腸球菌的生物學(xué)作用較單味藥更顯著，作用于菌體細(xì)胞的機(jī)制可能為:大黃、蛇床子可以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)菌胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、阻礙能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞;從而有利于黃芩、五倍子進(jìn)入菌體內(nèi)，發(fā)揮進(jìn)一步的抗菌活性，如使蛋白和酶變性或沉淀，溶解胞漿;抑制胞外基質(zhì)的生物合成等.

本研究提示，中藥復(fù)方對(duì)口腔致病糞腸球菌具有一定的抗菌效果，但其具體作用機(jī)制和量效關(guān)系還不明確，尚有待進(jìn)一步研究.

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