徐 艷， 陳 宇， 周玲玲， 劉思初， 楊力建，陳少華， 羅更新， 李揚(yáng)秋，

(暨南大學(xué)1.再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632;3.第一附屬醫(yī)院 血液科，廣東 廣州 510630)

T細(xì)胞-急性淋巴細(xì)胞白血病 (T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是以T細(xì)胞克隆性增生、積聚及組織浸潤為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病，其惡性程度高、耐藥和易復(fù)發(fā)、治療效果差且預(yù)后不良［1］.因此，研究T細(xì)胞腫瘤的一個(gè)重要目標(biāo)就是尋找更有效和特異的治療方案.近年已有報(bào)道了一些針對T細(xì)胞靶基因的單抗和干擾性小分子RNA(small interfering RNA，siRNA)的實(shí)驗(yàn)研究，讓逐漸發(fā)展起來的靶向治療為T細(xì)胞腫瘤的治療帶來了新的希望［2］.本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)一些與T細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如BCL11B和PPP2R5C等在TALL細(xì)胞異常高表達(dá)，而在正常T細(xì)胞中表達(dá)水平很低［3-4］.并進(jìn)一步證明了靶向特異性小干擾RNA可下調(diào)BCL11B和PPP2R5C基因表達(dá)，抑制T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4和Jurkat細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］.而在RNA干擾處理的過程，是否對正常T細(xì)胞產(chǎn)生影響，值得進(jìn)一步研究.因此，本研究利用RT-PCR和基因掃描法分析了經(jīng)過PPP2R5C siRNA處理的T-ALL病人外周血T細(xì)胞的24個(gè)TCR Vβ亞家族的譜系分布和克隆性增殖情況，初步了解RNA干擾后，T-ALL患者T細(xì)胞的改變特點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 材料

樣本收集經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和免疫學(xué)確診的初發(fā)未治T-ALL編號為C1和C2病人2例肝素抗凝外周血.在無菌條件下，按常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，部分用于進(jìn)行RNA干擾等實(shí)驗(yàn)，部分直接用于提RNA.

1.2 方法

(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 利用前期已經(jīng)證明具有特異抑制PPP2R5C基因的siRNA(PPP2R5C-siRNA799，專利號:ZL201110340411.1分別處理2例T-ALL樣本PBMC，除了PPP2R5C-siRNA799實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)無關(guān)干擾序列RNA的陰性對照組(Scrambled non-silencing siRNA control，SC)和未予任何處理的與實(shí)驗(yàn)同步培養(yǎng)的空白對照組(Non-treated cells，NC).每組單次收集2.5×106/個(gè)處于對數(shù)生長期的TALL病人細(xì)胞，1 100 r/min離心10 min，完全去除上清;用100 μL預(yù)熱至室溫的NucleofectorTMSolution和Supplement混合液二者比例9∶2，即配即用;懸浮細(xì)胞;各組分別加入1 μL siRNA799或者SC，核轉(zhuǎn)染專用的移液管混勻后加入核轉(zhuǎn)杯，啟動核酸轉(zhuǎn)染儀特異性程序，根據(jù)指南，各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染時(shí)所選擇的程序原代T-ALL:U-014，轉(zhuǎn)染完成后立刻用核轉(zhuǎn)染試劑盒里配套的移液管將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液，接種于含體積百分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱37℃預(yù)熱過的，含體積百分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、質(zhì)量濃度均為0.06 mg/mL青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，空白對照組則直接接種于同樣預(yù)處理過的培養(yǎng)基中.每組均增設(shè)4個(gè)平行杯，總數(shù)為1.0×107/個(gè)原代T-ALL細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后接種于同一培養(yǎng)瓶中，終體積為20 mL，以保證各項(xiàng)檢測指標(biāo)所需的細(xì)胞數(shù)［6］.

(2)RNA提取和cDNA合成 分別收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞約2.0×106/個(gè)，離心去上清后加入0.8 mL TRIZOL試劑充分混勻按常規(guī)方法RNAzol試劑盒提取所收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA，并應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Power-Scrip tTMReverse)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后以RT-PCR檢測β2微球蛋白基因確定合成cDNA的質(zhì)量.

(3)PPP2R5C的相對定量分析 采用相對定量法分析T-ALL細(xì)胞中PPP2R5C基因相對mRNA的表達(dá)水平，以β2M為內(nèi)參照，利用 Ct值，計(jì)算 TALL細(xì)胞中PPP2R5C基因相對mRNA表達(dá)量，其計(jì)算公式為［7］:相對 mRNA 表達(dá)量 =2-△Ct×100%，其中，△Ct=Ct(PPP2R5C)-Ct(β2M).

(4)反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 根據(jù)Vβ24個(gè)亞家族基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的24個(gè)Vβ特異性上游引物，并在Cβ區(qū)設(shè)一Cβ下游引物，引物均由德國柏林TIB公司合成［8］.每一標(biāo)本分別以 Vβ1-24/Cβ24對引物進(jìn)行24次PCR檢測.PCR操作按文獻(xiàn)［9］.總反應(yīng)體積為 25 μL，其中含 1 μL cDNA，濃度為 0.1 mmol/L dNTP(包括 dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，任一 Vβ 引物和 Cβ 引物濃度為 0.5 μmol/L，1.25 U 聚合酶(Promega)，反應(yīng)在 PCR 緩沖:濃度分別為 1 mmol/L Tris-HCl，pH=8.3，5 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2及質(zhì)量濃度 0.01 g/L明膠中進(jìn)行，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min而 首次為3 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min且 末次為10 min，結(jié)束后保存于4℃中.各反應(yīng)均設(shè)陽性和陰性對照，并設(shè)正常對照.PCR產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為25 g/L瓊脂糖凝膠中電泳分析結(jié)果.

(5)T細(xì)胞克隆性分析

①標(biāo)記PCR產(chǎn)物 將首次TCR Vβ PCR產(chǎn)物標(biāo)上熒光素，10 μL的反應(yīng)體系含2.5 μL 的未標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物、濃度分別為 0.1 μmol/L Cβ-Fam 引物［10］、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、1.0 U Taq聚合酶和1×PCR緩沖液.PCR共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，退火溫度為66℃，其余條件同上.

②基因掃描分析(CDR3長度分析) 經(jīng)熒光素Fam標(biāo)記的PCR產(chǎn)物按比例混合去離子甲酰胺與標(biāo)準(zhǔn)品 (GeneScanTM-500-LIZTM，ABI，USA)，利用3100 DNA序列分析儀進(jìn)行基因掃描分析.電泳過程中所收集的不同位置和高度的峰表示產(chǎn)物的大小和含量;峰的形態(tài)提示產(chǎn)物的均一性即克隆性，當(dāng)PCR產(chǎn)物中所含的DNA擴(kuò)增片段大小一致時(shí)，電泳時(shí)，其遷移率完全相同，故在同一時(shí)間點(diǎn)通過掃描探頭，所顯示的結(jié)果為一單峰圖象，提示為PCR產(chǎn)物來自于CDR3長度完全相同的T細(xì)胞，即單克隆的細(xì)胞;而一主峰和少數(shù)小峰圖象提示產(chǎn)物主要來自同一克隆即為寡克隆性，而多峰圖象提示多克隆性;圖像介于多克隆與寡克隆圖像之間，呈一主峰明顯高于其他峰的圖像并有向寡克隆發(fā)展趨勢，提示為寡克隆增殖趨勢［11］.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后48 h T-ALL細(xì)胞PPP2R5C基因mRNA表達(dá)水平

T-ALL病人外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)染PPP2R5C-siRNA2后48 h，與SC組、NC組相比，轉(zhuǎn)染組2例T-ALL細(xì)胞的PPP2R5C的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)(圖1)，RNA干擾抑制PPP2R5C后，可明顯抑制T-ALL細(xì)胞增殖并在一定程度上誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

圖1 轉(zhuǎn)染48 h兩組T-ALL細(xì)胞PPP2R5C基因mRNA水平變化Fig.1 The relative expression level of PPP2R5C in mRNA from 2 cases with T-ALL after siRNA treatment at 48 h

2.2 TCR Vβ亞家族T細(xì)胞的表達(dá)和克隆性增殖情況

2例初發(fā)T-ALL樣本外周血中可以檢測到的NC組Vβ亞家族T細(xì)胞及其克隆(圖2)，病例1可檢測到 24個(gè) Vβ亞家族中的 17個(gè) Vβ亞家族(70.8%)，而病例2則可檢測到10個(gè) Vβ亞家族(41.7%)，多數(shù)Vβ亞家族T細(xì)胞呈多克隆性，病例1中Vβ9和Vβ17亞家族T細(xì)胞為寡克隆性，而病例2中，Vβ14和 Vβ16亞家族呈寡克隆性.T-ALL病人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過PPP2R5C-siRNA處理后，TCR Vβ亞家族表達(dá)率降低，病例1僅檢測到4個(gè)Vβ亞家族，病例2則僅檢測到3個(gè)Vβ亞家族，分別為 Vβ2，Vβ3，Vβ16 和 Vβ17.其中，有 3 個(gè) Vβ家族的克隆性模式發(fā)生改變，病例1中，Vβ3由多克隆轉(zhuǎn)變?yōu)楣芽寺。鳹β17則由寡克隆轉(zhuǎn)為多克隆，而病例2中，Vβ16也由寡克隆轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗫寺?但是，無關(guān)序列對照組(SC)中，病例1與2分別僅檢測到4個(gè)和5個(gè)Vβ亞家族，兩例病人中均可檢測到與未處理樣本相同的Vβ13亞家族的多克隆性T細(xì)胞.此外，病例1中，SC組的Vβ16亞家族T細(xì)胞的克隆性也發(fā)生改變，呈寡克隆性，與初發(fā)時(shí)樣本的多克隆性不同(圖2).

圖2 PPP2R5C-siRNA處理前后2例T-ALL(C1和C2)病人T細(xì)胞的Vβ亞家族的分布和克隆性分析Fig.2 The distribution and clonality of Vβ subfamilies in T cells from 2 cases with T-ALL(C1 and C2)before and post PPP2R5C-siRNA treatment

3 討論

蛋白磷酸酶2A(proten phosphatase 2A，PP2A)作為一種主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在磷酸化信號平衡中起重要作用，調(diào)節(jié)并影響著許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化狀態(tài)，并與一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因表達(dá)控制、DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育等相關(guān)，而PPP2R5C作為蛋白磷酸酶2A的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)亞單位，對其功能的發(fā)揮具有重要的作用.有研究表明PPP2R5C可能是一種抑癌基因，PPP2R5C異常的表達(dá)或表達(dá)模式的改變都可能影響正常細(xì)胞的增殖甚至導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［12］，提示PPP2R5C的異常高表達(dá)可能與T細(xì)胞腫瘤的形成有關(guān)，而T細(xì)胞腫瘤是一種惡性度高、治療效果差且易復(fù)發(fā)的血液腫瘤.除了常規(guī)治療方法外，目前尚未有較好的靶向治療方法，最主要的原因是難以找到一個(gè)具有普遍性的特異性靶向治療靶點(diǎn).在腫瘤性T細(xì)胞中異常表達(dá)的分子可以作為研制抑制T細(xì)胞腫瘤靶向分子藥物，已有報(bào)道抗Notch1單抗和小干RNA抑制在T細(xì)胞白血病中異常表達(dá)或突變的Notch1［13］.本研究小組的前期研究首先在1例TALL發(fā)現(xiàn)涉及 PPP2R5C基因重排，并導(dǎo)致PPP2R5C基因異常表達(dá)［14］，隨后還發(fā)現(xiàn)PPP2R5C在多種白血病中均呈高表達(dá)狀態(tài)［4］，提示有可能成為白血病靶向治療的一個(gè)靶點(diǎn).因此，通過研究RNA干擾技術(shù)篩選出2條高效抑制腫瘤T細(xì)胞PPP2R5C表 達(dá) 的 PPP2R5C-siRNA，分 別 為PPP2R5C-siRNA799和 PPP2R5C-siRNA991，并均已獲得國家發(fā)明專利授權(quán).

本研究進(jìn)一步利用PPP2R5C-siRNA799處理初發(fā)T-ALL病人外周血單個(gè)核細(xì)胞，初步研究結(jié)果顯示，PPP2R5C-siRNA對原代T-ALL細(xì)胞具有一定的抑制作用，但對細(xì)胞的整體生物學(xué)效應(yīng)影響還有待進(jìn)一步深入研究.本研究小組前期研究已經(jīng)提示，利用PPP2R5C-siRNA可以特異地抑制高表達(dá)PPP2R5C 的白血病 T 細(xì)胞［2，6］，而正常 T 細(xì)胞由于低表達(dá)PPP2R5C，受抑制作用可能相對較弱，但由于RNA干擾可能在一定程度上抑制正常細(xì)胞的功能，本研究小組曾報(bào)道靶向抑制白血病T細(xì)胞的BCL11B-siRNA對造血干祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)的增殖和分化無明顯的影響［15］.本研究的主要目的是進(jìn)一步分析PPP2R5C-siRNA對病人T細(xì)胞譜系的抑制作用，在初發(fā)T-ALL病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中，絕大部分T細(xì)胞為來自克隆性增殖的腫瘤細(xì)胞，而仍有小部分正常T細(xì)胞，可由不同TCR亞家族T細(xì)胞組成，在分析2例初發(fā)T-ALL病人外周血的TCR Vβ亞家族表達(dá)情況時(shí)可見，病人外周血中的確存在多個(gè)家族多克隆性的正常T細(xì)胞亞家族，這和我們既往報(bào)道的結(jié)果相似［16］.由于本研究的主要目的是分析PPP2R5C-siRNA對TCR Vβ亞家族表達(dá)和克隆性的影響，因此，本研究并沒有特別鑒定T-ALL所屬的腫瘤性T細(xì)胞克隆，盡管可以檢測到2例TALL中均存在寡克隆性增殖的T細(xì)胞，但未能明確哪一個(gè)為腫瘤性T-ALL，明確鑒定腫瘤性T-ALL克隆，可通過流式細(xì)胞術(shù)或精細(xì)定位的寡核苷酸陣列比較基因組雜交(FT-aCGH)技術(shù)加以鑒定［17］.本研究已經(jīng)明確病例2的T-ALL克隆為TCRγδ+T細(xì)胞(結(jié)果未報(bào)道)，因此，所分析的TCR Vβ亞家族T細(xì)胞代表正常T細(xì)胞的增殖情況.經(jīng)過siRNA干擾處理48 h后，2例樣本中僅能檢測到3或4個(gè)Vβ亞家族的T細(xì)胞，提示PPP2R5C-siRNA干擾處理對Vβ亞家族的T細(xì)胞的增殖具有總體上的抑制作用，但發(fā)現(xiàn)在無關(guān)序列對照組(SC)檢測也僅能檢測到略為增多的TCR Vβ亞家族.因此，需要同時(shí)考慮的因素是小干擾RNA的非特異性抑制作用，還需要增加樣本數(shù)，健康人外周血T細(xì)胞的RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究，采用其他的轉(zhuǎn)染方式等等，進(jìn)一步排除各種因素和明確PPP2R5C-siRNA對各TCR亞家族T細(xì)胞的影響.此外，由于PPP2R5C-siRNA的特異性抑制主要針對高表達(dá)PPP2R5C細(xì)胞，而對于白血病T細(xì)胞所表達(dá)的TCR譜系沒有直接的影響.因此，本研究更主要的是觀察通用性的抑制影響，至于哪些正常TCR家族的T細(xì)胞受累與否可能與其自身表達(dá)水平有關(guān)聯(lián).

總之，本研究中分析RNA干擾下調(diào)白血病T細(xì)胞PPP2R5C基因表達(dá)后，T-ALL患者外周血TCR Vβ各亞家族T細(xì)胞的分布特點(diǎn)和克隆性改變的情況，初步認(rèn)為PPP2R5C-siRNA在抑制白血病T細(xì)胞的同時(shí)，可能對某些TCR亞家族T細(xì)胞有一定的抑制作用，也可能會對T細(xì)胞的增殖能力和功能造成短時(shí)間的影響，提示在未來設(shè)計(jì)基因靶向治療T細(xì)胞白血病時(shí)，同時(shí)需要考慮T細(xì)胞免疫功能的改善問題.但仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來發(fā)現(xiàn)其規(guī)律性和提供更全面的資料.

［1］ AIFANTIS I，RAETZ E，BUONAMICI S.Molecular pathogenesis of T-cell leukaemia and lymphoma［J］.Nat Rev Immunol，2008，8(5):380-390.

［2］ 李揚(yáng)秋，劉啟發(fā).血液腫瘤靶向治療和免疫治療［J］.腫瘤防治研究，2004，31(6):封二，355.

［3］ HUANG X，CHEN S，SHEN Q，et al.Analysis of the expression pattern of the BCL11B gene and its relatives in patients with T-cell acute lymphoblastic leukemia［J］.J Hematol Oncol，2010，3(1):44.

［4］ ZHENG H，CHEN Y，CHEN S，et al.Expression and distribution of the PPP2R5C gene in leukemia［J］.J Hematol Oncol，2011，4(1):21.

［5］ HUANG X，CHEN S，SHEN Q，et al.Down regulation of BCL11B expression inhibits proliferation and induces apoptosis in malignant T cells by BCL11B-935-siRNA［J］.Hematology，2011，6(4):236-242.

［6］ CHEN Y，LIU S，SHEN Q，et al.Differential gene expression profiles of PPP2R5C-siRNA-treated malignant T cells［J］.DNA Cell Biol，2013，32(10):573-581.

［7］ CIOCA D P，AOKI Y，KIYOSAWA K.RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines［J］.Cancer Gene Ther，2003，10(2):125-133.

［8］ XUAN L，WU X L，ZHANG Y，et al.Granulocyte colony-stimulating factor affects the distribution and clonality of TRGV and TRDV repertoire of T cells and graft-versushost disease［J］.J Transl Med，2011，9(1):215.

［9］ 李揚(yáng)秋，陳少華，楊力建，等.CML病人TCR+Vβ21寡克隆T細(xì)胞及其CDR3序列特點(diǎn)［J］.免疫學(xué)雜志，2000，16(3):189-192.

［10］ 李揚(yáng)秋，汪明春，楊力建，等.基因掃描分析B-CLL的TCR Vβ亞家族T細(xì)胞的表達(dá)和克隆性［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，1998，6(3):210-213.

［11］ 胡峻巖，吳秀麗，陳少華，等.B-ALL患者外周血γδT細(xì)胞TCR亞家族譜系分布和增殖特點(diǎn)［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29(2):147-151.

［12］ 李揚(yáng)秋，周羽竝，楊力建.PPP2R5C基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)生物學(xué)功能［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2009，17(5):1127-1129.

［13］ SARMENTO L M，BARATA J T.Therapeutic potential of Notch inhibition in T-cell acute lymphoblastic leukemia:rationale，caveats and promises［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11(9):1403-1415.

［14］ 陳 宇，鄭海濤，陳少華，等.PPP2R5C轉(zhuǎn)錄本在正常人和血液腫瘤病人中的分布情況［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，31(6):550-554.

［15］ SHEN Q，HUANG X，CHEN S，et al.BCL11B suppression does not influence CD34(+)cell differentiation and proliferation［J］.Hematology，2012，17(6):329-333.

［16］ 黃梅娟，李揚(yáng)秋，陳少華，等.T-ALL及T細(xì)胞株相關(guān)TCR Vβ基因譜系和克隆性分析［J］.免疫學(xué)雜志，2004，20(6):439-442.

［17］ 鄭海濤，葉鐵真，陳少華，等.利用Fine-tiling aCGH分析TCR基因重排鑒定T細(xì)胞白血病克?。跩］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27(5):483-486.