李金祥，孫 巖，王雅琳

(遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連 116029)

固相萃取與毛細(xì)管電泳在線聯(lián)用接口的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)

李金祥，孫 巖，王雅琳

(遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連 116029)

研究報(bào)道一種用于固相萃取與毛細(xì)管電泳在線聯(lián)用的新接口。該接口采用流動(dòng)閥原理和鞘流式設(shè)計(jì)，操作條件優(yōu)化后, 對(duì)接口的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 利用該接口, 進(jìn)樣效率高達(dá)98%, 表明該接口內(nèi)不存在樣品稀釋效應(yīng); 4 h內(nèi)100次連續(xù)進(jìn)樣的峰高、峰面積及遷移時(shí)間的RSD平均值分別為2.4 %、5.4 %、3.1 %, 表明該接口具有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

固相萃?。幻?xì)管電泳；接口

毛細(xì)管電泳分析法(capillary electrophoresis, CE)因具有柱效高、速度快、樣品和試劑消耗少和分離模式多等諸多優(yōu)點(diǎn)而獲得廣泛關(guān)注。 該方法通常利用光學(xué)原理進(jìn)行柱上檢測(cè)。 然而, 由于進(jìn)樣體積和毛細(xì)管內(nèi)徑的制約, 毛細(xì)管電泳光檢測(cè)分析法的濃度靈敏度較低, 致使該方法的應(yīng)用范圍受到了嚴(yán)重限制[1]。解決該問題最有效的方法之一是, 在進(jìn)行電泳分離之前, 利用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)濃縮[2-5]。 為了實(shí)現(xiàn)SPE與CE的高效在線聯(lián)用, 需要一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的接口。 迄今為止, 已經(jīng)報(bào)道了多種聯(lián)用接口[6-12], 這些接口可以實(shí)現(xiàn)SPE和CE的聯(lián)用, 并在不同程度上獲得了成功, 但仍存在許多問題。最主要的問題是接口的死體積過(guò)大, 導(dǎo)致了嚴(yán)重的樣品擴(kuò)散和稀釋效應(yīng), 致使萃取效率降低。

本研究設(shè)計(jì)了一種新的鞘流式流動(dòng)閥接口, 使死體積被減小至納升級(jí), 降低了樣品的稀釋效應(yīng), 從而提高了進(jìn)樣效率。同時(shí)接口具有制作簡(jiǎn)單、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見光檢測(cè)器(Model 500, Lab Alliance, 美國(guó)); 恒流注射器泵(LSP01-1 A, 保定蘭格); 高壓直流電源(±30 kV, 北京英達(dá)科技); 顯微鏡(XSP-02-640x, 江西鳳凰); 數(shù)碼攝像頭(深圳奧尼); 繼電器開關(guān)板(深圳龍崗); 雙通道色譜工作站(N-3000, 浙江大學(xué)); 微型精密酸度計(jì)(B-212, 日本); 超聲波清洗儀(SK2200H, 上?？茖?dǎo)); 石英毛細(xì)管(河北永年)。

1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸鈉鹽(H酸, C10H9NO7S2); 8-羥基喹啉-5-磺酸(C9H7NO4S); Na3PO4、NaOH (天津市天河化學(xué)試劑廠); 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水; 所有無(wú)機(jī)試劑均為分析純。

1.2 SPE-CE系統(tǒng)裝置

聯(lián)用系統(tǒng)裝置如圖1所示。SPE柱被一段內(nèi)徑為25 μm, 長(zhǎng)度為10 cm的毛細(xì)管空柱所取代, 用一個(gè)恒流泵(上) 以一定速度驅(qū)動(dòng)樣品流經(jīng)該毛細(xì)管到達(dá)接口內(nèi), 模仿SPE洗脫過(guò)程, 進(jìn)而簡(jiǎn)化了 SPE系統(tǒng)。顯微鏡與數(shù)碼攝像頭相連, 聚焦于接口的中心部位直接觀察和錄像。兩個(gè)直流高壓電源分別預(yù)設(shè)在一個(gè)較低和一個(gè)較高的電壓下, 用來(lái)電動(dòng)進(jìn)樣和電泳分離。電泳毛細(xì)管內(nèi)徑50 μm, 外徑375μm, 總長(zhǎng)30 cm, 有效長(zhǎng)度13 cm。用 UV 檢測(cè)器進(jìn)行柱上檢測(cè)，恒流泵(下)驅(qū)動(dòng)緩沖電解質(zhì)溶液流過(guò)接口控制CE進(jìn)樣，兩個(gè)電源和緩沖液泵由繼電器開關(guān)板自動(dòng)控制。石英毛細(xì)管在使用前, 依次用0.1 mol·L-1NaOH 溶液、水和Na3PO4緩沖溶液各沖洗5 min。

圖1 SPE-CE系統(tǒng)裝置示意圖

1.3 接口裝置

鞘流式流動(dòng)閥接口裝置如圖2所示。樣品毛細(xì)管出口與電泳毛細(xì)管入口之間存有一定縫隙, 二者同軸放置在同一水平通道中。緩沖液從毛細(xì)管外壁與連接管內(nèi)壁之間所形成的環(huán)形通道流過(guò), 一部分流入 CE 系統(tǒng)中, 使樣品在高壓電場(chǎng)下分離, 其余部分則攜帶 SPE 柱流出物成廢液流出。CE 分離結(jié)束后, 分離電壓回零。此時(shí), 緩沖液停止流動(dòng), 樣品流出液則直接收集在兩個(gè)毛細(xì)管縫隙之間, 在進(jìn)樣電壓下實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣。

圖2 鞘流式流動(dòng)閥接口結(jié)構(gòu)示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 接口操作條件的優(yōu)化

對(duì)于接口的操作來(lái)說(shuō), 影響其性能的因素主要包括 SPE 與 CE 毛細(xì)管之間的間距、緩沖液的流速、積累與進(jìn)樣時(shí)間、沖洗時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol·L-1H酸為待測(cè)液, 其流速設(shè)定為3 μL·min-1; 10 mmol·L-1Na3PO4溶液為緩沖液, 對(duì)接口的操作條件進(jìn)行了優(yōu)化。

經(jīng)過(guò)優(yōu)化, SPE 與 CE 毛細(xì)管間的距離70～120 μm 為宜。若間距過(guò)大, 會(huì)造成進(jìn)樣量重現(xiàn)性的降低, 而且所需的樣品積累時(shí)間也要相應(yīng)的加長(zhǎng); 而間距過(guò)小, CE 毛細(xì)管入口端的殘余組分不易被及時(shí)地沖洗干凈。緩沖液的流速范圍為16～80μL·min-1, 若流速低于16μL·min-1, 緩沖液的沖洗力度不夠, 不能保證樣品溶液全部遠(yuǎn)離 CE 毛細(xì)管入口端, 會(huì)造成連續(xù)進(jìn)樣現(xiàn)象; 而流速大于80μL·min-1時(shí), 易產(chǎn)生殘壓和層流現(xiàn)象, 譜圖上峰高降低且出峰時(shí)間縮短。此外, 適宜的時(shí)間程序: 積累與進(jìn)樣時(shí)間為3 s, 沖洗時(shí)間為1s。

2.2 接口性能的評(píng)價(jià)

本研究在上述優(yōu)化的操作條件下, 主要從進(jìn)樣效率、重現(xiàn)性、柱效與對(duì)稱性三方面對(duì)接口的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2.2.1 接口的進(jìn)樣效率

接口的進(jìn)樣效率, 即樣品在接口的濃度利用率, 直接影響到系統(tǒng)對(duì)樣品的檢測(cè)濃度。以5 mmol·L-1的H酸為研究對(duì)象, 在相同的操作條件下, 分別采用直接電泳進(jìn)樣、經(jīng)接口進(jìn)樣兩種方式進(jìn)行CE分離比較, 選取所得譜圖的一部分進(jìn)行排列, 結(jié)果如圖3所示。從峰高即濃度的比值中可推知樣品經(jīng)接口切換后濃度為初始濃度的98 %, 這表明在積累與進(jìn)樣的過(guò)程中, 樣品幾乎沒被稀釋。經(jīng)計(jì)算比較得知, 兩個(gè)毛細(xì)管間距離為100 μm時(shí)的死體積為20 nL, 而積累與進(jìn)樣時(shí)間為3 s時(shí)樣品的流出體積為150 nL, 是死體積的7.5倍。也就是說(shuō), 此時(shí)兩個(gè)毛細(xì)管間全部充滿著樣品, 因而進(jìn)樣的濃度幾乎就是樣品的原始濃度。這進(jìn)一步說(shuō)明了該鞘流接口的死體積小, 稀釋效應(yīng)小, 從而不會(huì)對(duì)萃取效率帶來(lái)影響。

圖3 直接電泳進(jìn)樣與經(jīng)接口進(jìn)樣的比較

2.2.2 接口的重現(xiàn)性

為了評(píng)價(jià)接口的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 以5 mmol·L-1H酸為樣品, 在約 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行了100次電泳連續(xù)進(jìn)樣實(shí)驗(yàn), 峰高、峰面積、遷移時(shí)間的散點(diǎn)圖如圖4所示。經(jīng)計(jì)算, 峰高、峰面積及遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)平均值分別為2.4 %、5.4 %、3.1 %, 均在誤差允許范圍內(nèi)。從圖中可以看出, 峰高、峰面積并沒有明顯的漂移, 但遷移時(shí)間卻從1.52 min漂移到了1.65 min, 造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)緩沖溶液 pH 和室溫發(fā)生了變化。研究發(fā)現(xiàn), 在這一時(shí)間段內(nèi), 由于緩沖溶液吸收了空氣中的二氧化碳使得其 pH 從 11.5 降至 11.2, 室溫從29 ℃降至25 ℃, 溫度的下降會(huì)導(dǎo)致緩沖液粘度的增加。pH 的降低和粘度的增加均會(huì)使電滲流有所下降, 遷移時(shí)間漂移。即便這樣, 所得的結(jié)果也表明該套系統(tǒng)足以實(shí)現(xiàn)SPE 與 CE 的高效在線聯(lián)用。

圖4 100次連續(xù)CE分離的峰高、峰面積及遷移時(shí)間

2.2.3 柱效與對(duì)稱性

在檢測(cè)波長(zhǎng) 250 nm 的情況下, 通過(guò)分離 H 酸和 8-羥基喹啉-5-磺酸的混合溶液考察了接口對(duì)CE分離的影響。表1對(duì)比了直接電泳進(jìn)樣和經(jīng)接口進(jìn)樣時(shí)兩種組分的柱效和峰的對(duì)稱性。因UV檢測(cè)的濃度靈敏度較低, 增大樣品濃度, 增加進(jìn)樣體積或增加檢測(cè)窗口長(zhǎng)度都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬。此外, 與壓力進(jìn)樣相比, 電動(dòng)進(jìn)樣中存在電荷歧視效應(yīng), 更容易造成峰展寬現(xiàn)象, 使得柱效損失。從峰的頂點(diǎn)向半峰寬所在線段作垂線, 相交后的形成的兩條線段分別為 a 和 b, b 與 a 的比值即為峰的對(duì)稱性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)峰形拖尾, 造成這一現(xiàn)象的原因一方面是由于在分離過(guò)程中樣品栓在電泳毛細(xì)管中軸向擴(kuò)散, 另一方面是由于電荷歧視效應(yīng)的存在使得分析物的自身泳動(dòng)方向與電滲流方向相反。但在適當(dāng)?shù)牟僮鳁l件下, 經(jīng)接口進(jìn)樣與直接電泳進(jìn)樣相比, 柱效和對(duì)稱性變化不大, 說(shuō)明接口并沒有對(duì)CE的分離帶來(lái)影響。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取性能良好且成本低廉的材料，設(shè)計(jì)并制作了一種新型鞘流式流動(dòng)閥接口裝置，通過(guò)對(duì)電泳進(jìn)樣重現(xiàn)性和稀釋效應(yīng)的考察證實(shí)，本接口在吸納現(xiàn)有幾種接口裝置的優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，有效克服了缺陷，具有制作方法簡(jiǎn)單、制作成本低廉、柱外擴(kuò)散和稀釋效應(yīng)極小等顯著優(yōu)點(diǎn)?？梢院芎玫貙?shí)現(xiàn)固相萃取與毛細(xì)管電泳的在線聯(lián)接。

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Design and Evaluation of a New Interface for the On-line Coupling of Solid-phase Extraction with Capillary Electrophoresis

LI Jin-xiang, SUN Yan, WANG Ya-lin

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian Liaoning 116029, China)

A new interface was presented for the on-line coupling of solid-phase extraction (SPE) with capillary electrophoresis (CE). The interface adopted a sheath flow design based on the flow gating principle. After optimizing the operation conditions, the performance of the interface was evaluated. By this interface, injection efficiency of concentration of effluent form SPE capillary into the CE system was up to 98%, indicating that almost no dilution effect occurred during injections in the interface. The relative standard deviations (RSD%) obtained through 100 consecutive runs over a 4.0 h period were 2.4%, 5.4% and 3.1%, respectively. These RSD values shown that the interface has a good stability and reproducibility.

solid-phase extraction; capillary electrophoresis; interface

2013-10-16

李金祥(1964- )，男，黑龍江綏化人，遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授，博士，從事高效分離與靈敏檢測(cè)技術(shù)研究。

O657.7

A

1008-178X(2014)01-0069-04