肖忠華 苗加偉 黃海兵

作者單位：404120 重慶萬州 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校

基礎(chǔ)研究

以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選人肝細胞癌組織中失調(diào)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析

肖忠華 苗加偉 黃海兵

作者單位：404120 重慶萬州 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校

目的 分析從人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)驗證的失調(diào)蛋白相互作用，探討失調(diào)蛋白可能共同參與的生物學(xué)途徑。方法以蛋白質(zhì)組學(xué)和肝細胞癌為關(guān)鍵詞搜索Pubmed數(shù)據(jù)庫，人工篩選出從人HCC組織中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)驗證的失調(diào)蛋白；以蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)分析軟件PRINCESS分析失調(diào)蛋白的相互作用。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)8個蛋白間存在9對置信度評分大于2.0的失調(diào)蛋白相互作用，APEX1分別與ILF2、PRDX3、ANP32A、MATR3兩兩相互作用，SULT1A1與PDIA6兩兩相互作用。結(jié)論 APEX1、ILF2、PRDX3、ANP32A、MATR3、IQGAP2可能在HCC發(fā)生、發(fā)展中經(jīng)歷同一生物學(xué)通路。

肝細胞癌；失調(diào)蛋白；蛋白質(zhì)相互作用；生物學(xué)通路

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球病死率較高的常見惡性腫瘤之一［1］。近十年來，高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從人HCC組織中尋找潛在的HCC早期診斷、預(yù)后監(jiān)測生物標志物和治療的藥物靶標成為最有效的研究方法之一［2］，而蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析方法的發(fā)展則為進一步揭示HCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后機制提供了新的有力工具。PRINCESS（protein interaction confidence evaluation system with multiple source）為北京蛋白質(zhì)組學(xué)中心開發(fā)的在線免費蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)分析軟件，采用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)算法，利用多種高通量蛋白質(zhì)相互作用生物學(xué)證據(jù)，包括model organism protein-protein interaction（模式生物蛋白相互作用）、interaction domain（蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域）、GO coannotation（GO數(shù)據(jù)庫共注釋）、gene coexpression（基因共表達）、genome context（基因組上下文）、network topology（網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)）等評估蛋白質(zhì)相互作用置信度，蛋白質(zhì)相互作用置信度評分大于2.0，表明該相互作用可信度高并為已有研究所證實，因而是一種靈敏性和特異性均較高的預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的工具［3］。本實驗利用Pubmed數(shù)據(jù)庫篩選近年以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從人HCC組織發(fā)現(xiàn)并驗證失調(diào)蛋白研究的文獻，采用PRINCESS分析篩選文獻中人HCC組織失調(diào)蛋白的相互作用，以期為從人HCC組織失調(diào)蛋白的相互作用揭示HCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的可能機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 人HCC組織失調(diào)蛋白的獲得

以“HCC and proteomics”為關(guān)鍵詞，限制條件為近5年和人類，搜索Pubmed數(shù)據(jù)庫。按照以下條件人工篩選文獻：⑴以人HCC組織為研究對象；⑵失調(diào)蛋白經(jīng)Western Blot或免疫組化等方法驗證，逐一閱讀文獻摘要或全文，獲得以蛋白質(zhì)組學(xué)方法從人HCC組織中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)驗證的失調(diào)蛋白。

1.2 人HCC組織失調(diào)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析

將以上1.1獲得的失調(diào)蛋白在線提交PRINCESS（http：//61.50.138.118/picasso/），在提交可能相互作用蛋白對列表下選項select organism（選擇物種）項下選擇homo sapiens（人類）；在輸入蛋白質(zhì)或基因名類型項下選擇entrez Gene symbol（entrez基因符號）；在置信度評估選擇相互作用生物學(xué)證據(jù)源項下勾選Model organism protein-protein interaction、interaction domain、GO coannotation、gene coexpression、genome context、network topology等全部選項，以上6項選項均設(shè)置為默認設(shè)置；輸入相互作用置信度評分截斷值2.0；點擊”start”（開始），PRINCESS自動進行蛋白相互作用分析并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；將置信度評分大于2.0的相互作用失調(diào)蛋白再次在線提交PRINCESS，構(gòu)建置信度評分大于2.0失調(diào)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 獲得的人HCC組織失調(diào)蛋白

按照1.1篩選的文獻18篇，共獲得22個失調(diào)蛋白，其中，在人HCC組織中上調(diào)蛋白分別為：CapG（macrophage-capping protein，巨噬細胞加帽蛋白）［4］、hnRNP K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，核內(nèi)不均一核糖核蛋白K）［5］、hnRNP A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1）［6］、PRDX3（peroxiredoxin 3，硫氧還原蛋白過氧化物酶3）［7］、ANP32A（acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A，酸性富亮氨酸核磷蛋白32家族成員A）［8］、APEX1（apurinic/ apyrimidinic exonuclease 1，脫嘌呤/脫嘧啶外切核酸酶1）［8］、TUBA1C（tubulin alpha-6 chain，微管相關(guān)蛋白α6）［9］、MATR3（matrin 3，核基質(zhì)蛋白3）［10］、LETM1（Leucine zipper/EF-hand-containing Transmembrane protein 1，亮氨酸拉鏈EF-hand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1）［10］、ILF2（interleukin enhancer binding factor 2，白介素增強子結(jié)合因子2）［10］、CIB1（calcium and integrin-binding protein 1，鈣整合素結(jié)合蛋白1）［11］、TLN1（talin-1，踝蛋白 1）［12］、NDRG1（N-myc downstream-regulated gene 1，N-myc下游調(diào)控蛋白1）［13］、PDI A6（protein disulfide-isomerase A6，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A6）［14］、RhoA（Ras homolog gene family member A，Ras同源基因家族成員A）［15］、c-kit（原癌基因C-KIT編碼的Ⅲ型受體酪氨酸蛋白激酶家族成員）［16］、GS（glutamine synthetase，谷氨酰胺合成酶）［17］、vimentin（波形蛋白）［18］、FUBPs（far upstream element binding proteins，遠距上游結(jié)合蛋白）［19］、EB1（endbinding protein EB1，微管相關(guān)末端結(jié)合蛋白1）［20］；人HCC組織中下調(diào)蛋白分別為IQGAP2（IQ motif containing GTPase activating protein 2，含IQ基元GTP酶激活蛋白2）［10］和SULT1A1（sulfotransferases 1A1,硫酸基轉(zhuǎn)移酶）［21］。

2.2 人HCC組織失調(diào)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)

按照2.1在線提交“PINCESS”22個失調(diào)蛋白之間231對可能失調(diào)蛋白相互作用組合，結(jié)果22個蛋白中10個蛋白之間有45對蛋白相互作用，這10個蛋白分別為APEX1、ILF2、PRDX3、ANP32A、IQGAP2、MATR3、SULT1A1、PDIA6、NDRG1、LETM1；其中APEX1、ILF2、PRDX3、ANP32A、IQGAP2、MATR3、SULT1A1、PDIA6等8個蛋白之間有9對蛋白相互作用置信度評分大于2.0，在interaction domain、GO coanotation、gene coexpression、network topology等方面有生物學(xué)證據(jù)；其余36對蛋白相互作用評分介于0～2.0之間。10個蛋白之間45對蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)如圖1；8個蛋白之間9對置信度評分大于2.0蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)如圖2；8個蛋白之間9對置信度評分大于2.0蛋白相互作用的生物學(xué)證據(jù)如表1。

圖1 10個蛋白之間45對蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)

圖2 8個蛋白之間9對蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)

表1 PRINCESS分析失調(diào)蛋白相互作用的生物學(xué)證據(jù)

3 討論

通過Pubmed數(shù)據(jù)庫篩選期刊文獻，獲得近年以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從人HCC組織中發(fā)現(xiàn)并驗證的失調(diào)蛋白22個，以蛋白質(zhì)相互作用評估軟件分析，置信度評分大于2.0的9對蛋白相互作用由8個蛋白產(chǎn)生。在這些蛋白中，PRDX3屬于過氧化物酶基因蛋白家族，定位于線粒體。Qiao等［7］的研究表明，PRDX3不僅在HCC組織中高表達，而且其表達水平與HCC臨床分期相關(guān)，尤其在轉(zhuǎn)移HCC中的表達最多，HCC組織上調(diào)PRDX3，減少細胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過氧化氫誘導(dǎo)的細胞凋亡。MATR3、ILF2、IQGAP2為同一研究所發(fā)現(xiàn)［10］，MRTR3和ILF2在細胞核中的表達上調(diào)，而IQGAP2在細胞骨架中的表達下調(diào)，MATR3、ILF2在調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄活性中起著重要作用，IQGAP2對維持細胞正常形態(tài)與功能具有重要的作用，可能是一種新的抑癌基因。APEX1具有氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄共激活、DNA修復(fù)酶等多種生物學(xué)功能，ANP32A可參與細胞增殖、分化、caspase依賴或caspase不依賴凋亡、腫瘤抑制、mRNA運輸調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程。Li等［8］在蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究HCC組織中上調(diào)蛋白分子復(fù)合物研究中揭示：ANP32A、APEX1在HCC組織全細胞中高表達，細胞核中的高表達與臨床分期密切相關(guān)；核內(nèi)ANP32A、APEX1、SET（HLA-DR-associated proteinⅡ，HLA-DR相關(guān)蛋白2亞型1）、HMGB2（high mobilitygroup protein B2，高遷移家族蛋白B2）4個蛋白形成以SET為中心的分子復(fù)合物參與細胞氧化應(yīng)激過程中GzmA（Granzyme A，顆粒蛋白酶A）介導(dǎo)的凋亡通路。而我們的研究中APEX1、ILF2、PRDX3、ANP32A、IQGAP2、MATR3 6個蛋白處于一個相互作用網(wǎng)絡(luò)，除IQGAP2與APEX1間接相互作用外，其余4個蛋白均直接與APEX1有高置信度的直接相互作用，推測這6個蛋白可能在HCC發(fā)生、發(fā)展中經(jīng)歷同一生物學(xué)通路，或有可能也以SET蛋白為中心組成分子復(fù)合物參與HCC進程。硫酸基轉(zhuǎn)移酶1A1是一種重要的解毒酶，在Yeo等［21］的研究中該蛋白的表達下調(diào)導(dǎo)致細胞解毒能力下降可能增加HCC發(fā)生的風險，而PDIA6屬于蛋白質(zhì)二硫化異構(gòu)酶家族，可能激活組織因子的損傷響應(yīng)信號從而促進癌栓形成［22］。在我們構(gòu)建的置信度大于2.0的失調(diào)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)中，SUL1A1和PDIA6直接相互作用，推測SUL1A1下調(diào)和PDIA6上調(diào)可能為同一生物學(xué)通路激活。

發(fā)現(xiàn)機體疾病生物學(xué)通路是研究機體疾病發(fā)生、發(fā)展機制的重要策略［23，24］，其意義遠高于疾病過程中單個蛋白質(zhì)標志物的失調(diào)，從失調(diào)蛋白出發(fā)，發(fā)現(xiàn)不同研究所得失調(diào)蛋白之間的整體聯(lián)系，能更客觀反映疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵生物學(xué)通路。本文從Pubmed數(shù)據(jù)中以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選在人HCC組織中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)驗證的失調(diào)蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)相互作用分析軟件PRINCESS分析失調(diào)蛋白間的相互作用并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，推測APEX1、ILF2、PRDX3、ANP32A、IQGAP2、MATR3可能組成以SET為中心的分子復(fù)合物參并與HCC進程，同時SUL1A1和PDIA6可能為同一生物學(xué)通路。下一步，我們將設(shè)計試驗驗證以上可能的生物學(xué)通路。

應(yīng)該指出的是，沒有參與構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)蛋白和所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中沒有顯示為高置信度相互作用的失調(diào)蛋白，并不代表他們之間沒有高置信度相互作用，而只是目前的研究中尚未涉及而已。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中還給出了PRINCESS預(yù)測的與當前研究中發(fā)現(xiàn)的失調(diào)蛋白高置信度相互作用的蛋白，同時研究網(wǎng)絡(luò)中有興趣的蛋白可能更全面地發(fā)現(xiàn)HCC發(fā)生、發(fā)展機制中的生物學(xué)通路，從而為探索HCC發(fā)生、發(fā)展的機制或?qū)ふ宜幬锇袠颂峁┻M一步的依據(jù)。

（致謝：北京蛋白質(zhì)組學(xué)中心）

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［2014-07-23收稿］［2014-08-25修回］［編輯 阮萃才］

Identifying deregulated networks of protein-protein interactions through proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma tissue

XIAO Zhong-hua，MIAO Jia-wei，HUANG Hai-bing（Chongqing Three Gorges Medical School，Chongqing Wanzhou 404120，P.R.China）

XIAO Zhong-hua.E-mail：xiaozhonghua1010@126.com

Objective To analyze human hepatocellular carcinoma tissue using proteomics to identify possible deregulated networks of protein-protein interactions.Methods PubMed was searched using keywords“hepatocellular carcinoma”and“proteomics”to identify reports of proteins that are deregulated in the cancerous state.Then the proteins were analyzed for interactions using PRINCESS.Results Nine protein-protein interactions involving 8 proteins were assigned confidence scores＞2.0：APEX1 interacts directly with ILF2，PRDX3，ANP32A，and MATR3 and indirectly with IQGAP2.SULT1A1 interacts directly with PDIA6.Conclusion APEX1，ILF2，PRDX3，ANP32A，MATR3，and IQGAP2 may participate in a single network associated with onset and/or progression of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma；Deregulated proteins；Protein-protein Interaction；Biological pathway

R735.7

A

1674-5671（2014）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.08

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目（KJ131804）

肖忠華。E-mail：xiaozhonghua1010@126.com