程水明，趙俊仁（等）

摘要：為探討木瓜蛋白酶酶解海蜇（Rhopilema esculentum）腦蛋白質(zhì)的最佳工藝，考察了酶解溫度、酶用量、固液比、酶解時(shí)間、pH對(duì)海蜇腦蛋白酶解的影響，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化了工藝參數(shù)。結(jié)果表明，以酶用量3 000 U/g、pH 5、酶解溫度45 ℃、固液比1∶4、酶解2 h為最優(yōu)酶解參數(shù)組合，驗(yàn)證試驗(yàn)得到蛋白質(zhì)平均水解度為50.11%，表明該優(yōu)化工藝可行。

關(guān)鍵詞：海蜇（Rhopilema esculentum）；蛋白質(zhì)酶解；木瓜蛋白酶；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS254.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1649-05

Optimizing Enzymolysis Process of Protein from Jellyfish Brain via Papain Protease

CHENG Shui-ming，ZHAO Jun-ren，WANG Chun，LIANG Jian-tao，ZHANG Qing

（College of Chemistry and Life Science， Guangdong University of Petrochemical Technology， Maoming 525000， Guangdong， China）

Abstract： The optimal technology for enzymolysis of jellyfish（Rhopilema esculentum） brain protein by papain protease was investigated. Effects of enzymolysis temperature， the amount of added enzyme， solid/liquid ratio， enzymolysis time and pH on the enzymolysis of total protein were studied through single factor experiments. Technical parameters were optimized by orthogonal experiments. The results showed that the amount of added enzyme of 3 000 U/g， pH 5， enzymolysis temperature of 45 ℃， solid/liquid ratio of 1∶4 and the amount of added enzyme time for 2 h were the optimal combination of parameters for the enzymolysis. The average degree of hydrolysis obtained from the verification tests was 50.11%， indicating that the optimized results of the orthogonal experiment were workable.

Key words： jellyfish （Rhopilema esculentum）； protein enzymolysis； papain protease； orthogonal experiment

海蜇（Rhopilema esculentum）俗稱鲊魚、海蛇，屬于根口水母科（Rhizootomatidae）、海蜇屬（Rhopilema）的無(wú)緣膜動(dòng)物，廣泛分布在我國(guó)南海、東海、黃海和渤海，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，營(yíng)養(yǎng)豐富，脂肪含量低，蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽類等的含量豐富[1-4]，含有不飽和脂肪酸AA、EPA和DHA等[5]?？芍委煾哐獕骸⒅夤苎?、淋巴結(jié)核等病癥。海蜇中所含的活性物質(zhì)，如功能蛋白、多糖等有很好的保健作用，具有改善皮膚彈性、清除自由基、促進(jìn)新陳代謝等功效[6-9]。

我國(guó)海蜇年產(chǎn)量達(dá)70萬(wàn)t[10]，主要作為涼拌食品，加工食用海蜇主要利用其傘部，非食用部分占總體的28%，被用于生產(chǎn)魚粉供水產(chǎn)和陸地畜禽養(yǎng)殖，但由于加工技術(shù)落后，不但產(chǎn)品得率和附加值低，而且嚴(yán)重污染近海水域[11]。非食用部分直接丟棄而未被利用，會(huì)造成更為嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。海蜇廢棄物（腦）蛋白質(zhì)含量很高（約為腦干重的60%），且生長(zhǎng)在特殊環(huán)境（高鹽、高壓、低氧和低光照），其蛋白質(zhì)氨基酸組成或序列都與陸地生物蛋白質(zhì)有很大不同。所含生物活性物質(zhì)可能具有潛在的抗癌、抗病毒和抗衰老等作用，可作為人類治療疾病藥物的理想候選材料[12，13]。如采用生物工程手段對(duì)這些廢棄物進(jìn)行酶控水解、膜分級(jí)、分離提取、純化等，精制成肽類產(chǎn)品及魚用蛋白質(zhì)，用作食品添加劑、蛋白強(qiáng)化劑或用作研制藥物和功能食品的原料，既可解決資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題，又可開發(fā)利用海蜇生物蛋白質(zhì)資源。

本研究主要通過酶解條件控制，探討木瓜蛋白酶酶解海蜇腦的主要工藝參數(shù)，為后續(xù)開發(fā)和利用海蜇資源，作為藥用或功能性食品提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海蜇腦采自廣東省茂名市電白縣博賀港，將新鮮海蜇腦洗凈，用組織勻漿機(jī)勻漿處理，置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫荒竟系鞍酌福?00 000 U/g）購(gòu)自廣西省龐博生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解試驗(yàn)流程 海蜇腦漿→鼓風(fēng)干燥→海蜇腦粉→混漿→分離純化蛋白質(zhì)（超聲波輔助提取）→鼓風(fēng)干燥→測(cè)定總蛋白質(zhì)含量→木瓜蛋白酶酶解→考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量→計(jì)算水解度。

1.2.2 蛋白質(zhì)超聲波輔助提取總蛋白質(zhì) 在料液比1∶1（質(zhì)量比），功率200 W，超聲處理時(shí)間10 s，其間靜置15 s，超聲次數(shù)為100次，分4組，每組間隔5 min，該過程均在冰浴中進(jìn)行。料液在12 000 r/min下離心10 min，取上清液置于70 ℃下滅活1 min，移入錐形瓶中，按1∶4（體積比）加去離子水，攪拌均勻，調(diào)pH為9，放入4 ℃冰箱中堿液（用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為6.5）提取12 h。取上清液3 000 r/min離心10 min，將離心后上清液轉(zhuǎn)入干凈錐形瓶，調(diào)pH為6.5，加飽和硫酸銨（74.5%），攪拌均勻后靜置10 min，4 000 r/min離心15 min，得到沉淀物，干燥，稱重，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白質(zhì)含量[14，15]。

1.2.3 酶解終點(diǎn)判斷 采用雙縮脲法進(jìn)行酶解終點(diǎn)的確定[4]。酶解后取樣進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，根據(jù)溶液顏色變化確定海蜇腦蛋白酶解終點(diǎn)。具體操作：在錐形瓶?jī)?nèi)加入2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，振蕩后加入3～4滴CuSO4溶液，振蕩、觀察；水解液為紫色表明海蜇腦蛋白水解不完全；水解液顏色無(wú)變化，則海蜇腦蛋白水解完全，可判斷此為水解終點(diǎn)。

1.2.4 水解率計(jì)算 利用分光光度法（波長(zhǎng)595 nm）測(cè)定并繪制牛血清蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算酶解清液中蛋白質(zhì)含量，按照下列公式求出水解率[16]。

水解率Q=■×100%

式中， X2為蛋白質(zhì)總重量（g），X3為酶解后蛋白質(zhì)重量（g）。

1.3 影響蛋白質(zhì)酶解的單因素試驗(yàn)

1.3.1 酶用量 取5 g蛋白質(zhì)粉置于錐形瓶中，按 1∶4（m∶V，下同）加入去離子水，pH為7，酶解溫度60 ℃，加入木瓜蛋白酶。酶用量分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g，酶解時(shí)間4 h。

1.3.2 酶解溫度 取5 g蛋白質(zhì)粉置于錐形瓶中，按1∶4加入去離子水，在pH為7，酶解溫度為45、50、55、60、65 ℃，酶用量為4 000 U/g的條件下酶解4 h。

1.3.3 pH 取5 g蛋白質(zhì)粉置于錐形瓶中，按1∶4加入去離子水， 調(diào)節(jié)pH為5、6、7、8、9， 酶解溫度60 ℃ ，酶解時(shí)間4 h，酶用量4 000 U/g的條件下酶解。

1.3.4 酶解時(shí)間 取5 g蛋白質(zhì)粉置于錐形瓶中，按照1∶4加入去離子水，pH為7，酶解溫度60 ℃，酶用量4 000 U/g，酶解時(shí)間為2、3、4、5、6 h的條件下酶解。

1.3.5 固液比 在pH為7，酶解溫度60 ℃，酶解時(shí)間4 h，酶用量4 000 U/g， 固液比分別為1∶3、 1∶4、1∶5、 1∶6、 1∶7的條件下進(jìn)行酶解。

以上各單因素試驗(yàn)酶解結(jié)束后用70 ℃熱水1 min滅活酶，冷卻至室溫，取樣測(cè)定蛋白質(zhì)含量并計(jì)算水解率。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響酶解的4個(gè)因素，加酶用量、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間。以每因素4個(gè)水平，采用L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)海蜇腦蛋白進(jìn)行酶解試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行處理，選出最佳的酶解條件。對(duì)最佳的酶解條件進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算水解率，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響

圖1結(jié)果表明，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率從31.6%上升到48.5%，在木瓜蛋白酶酶用量在2 000～3 000 U/g時(shí)，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率上升幅度較大；當(dāng)酶用量大于3 000 U/g后，水解率變化幅度較小。當(dāng)酶用量較小時(shí)，主要為酶控反應(yīng)；當(dāng)酶用量過高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，會(huì)阻礙酶對(duì)底物的水解。因此，雖然酶用量為5 000 U/g時(shí)，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率達(dá)到最大值，但從成本考慮，以添加酶用量3 000 U/g為宜。

2.2 pH對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響

從圖2可以看出，當(dāng)pH從5增加到6時(shí)，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率從 28.0%上升到37.8%，在pH為6時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)pH繼續(xù)增加，水解率則有所下降。這可能是由于酶的催化活性部分與海蜇腦蛋白質(zhì)本身可解離基團(tuán)充分解離，使酶的活性中心與蛋白質(zhì)底物充分結(jié)合，將底物最大程度地轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物，使水解率達(dá)到最大。

2.3 酶解溫度對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度從45 ℃增加到50 ℃，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率從21.4%上升到30.1%，在酶解溫度為50 ℃時(shí)，水解率達(dá)最大值；隨著溫度的繼續(xù)增加，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率則不斷下降，說明超過50 ℃后，由于溫度過高，引起木瓜蛋白酶受熱變性，使其活性開始減弱，水解率下降。因此，酶解溫度選擇50 ℃為宜。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響

圖4結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，木瓜蛋白酶對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率逐漸升高，水解率在3～4 h時(shí)增幅較大； 4 h后， 水解率增加幅度較小， 可能是隨時(shí)間延長(zhǎng)， 酶活力逐漸下降；在酶解時(shí)間為6 h時(shí)， 水解率達(dá)到最大值，但從成本及產(chǎn)業(yè)化考慮， 選擇酶解時(shí)間4 h為宜。

2.5 固液比對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響

由圖5可知，當(dāng)固液比從1∶3轉(zhuǎn)變?yōu)?∶4時(shí)，海蜇腦蛋白質(zhì)水解率增加，在固液比為1∶4時(shí)達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著固液比的降低，反應(yīng)體系的水分逐漸增加，從而降低了反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，減少了產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用。但由于水解率升降范圍較小，表明固液比對(duì)水解率的影響不大。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

為確定木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)水解率為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從極差R可知，酶用量對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率的影響最大，其次是酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間，通過比較得出酶解海蜇腦蛋白質(zhì)的最優(yōu)組合為A3B1C2D1，即酶用量為3 000 U/g、pH為5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h。在此工藝條件下，酶解海蜇腦蛋白質(zhì)水解率為53.76%。

采用SPSS軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，在本試驗(yàn)中，酶用量和pH對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)水解率影響均達(dá)到顯著水平，而酶解溫度和酶解時(shí)間在本試驗(yàn)條件下對(duì)水解率的影響均不顯著。根據(jù)F值的大小，4個(gè)因素對(duì)水解率影響的主次順序?yàn)椋好赣昧?gt;pH>酶解溫度>酶解時(shí)間，這與極差分析的結(jié)果一致。本試驗(yàn)的最佳工藝組合為A3B1C2D1，在該試驗(yàn)條件下，水解率為53.76%。但考慮到酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)水解率的影響均不顯著，故從節(jié)省時(shí)間、能源及操作方便性等角度出發(fā)，可選擇A3B1C1D1為水解條件，在此條件下對(duì)海蜇腦蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，水解率為50.11%。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)正交試驗(yàn)分析得出的最優(yōu)工藝進(jìn)行了5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解率分別為51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值為52.90%，均大于正交試驗(yàn)中得到的水解率。說明該最佳工藝條件是合理的、可靠的。

3 結(jié)論與討論

通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)的最佳條件為酶用量3 000 U/g、pH為5、酶解溫度為45 ℃、酶解時(shí)間2 h，固液比為1∶4，在此條件下水解海蜇腦蛋白質(zhì)，水解率可達(dá)50.11%。

本研究在蛋白質(zhì)提取過程中使用了超聲波輔助提取法，可有效提高海蜇腦蛋白質(zhì)提取效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約成本。超聲波能將蛋白質(zhì)粉碎、液化，減少蛋白質(zhì)的變性沉淀，得到優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[17]，安全可靠，對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響較小[18]，但在提取過程中產(chǎn)生的高溫會(huì)使小部分蛋白質(zhì)變性[19]，因此在使用超聲提取法過程中應(yīng)注意超聲處理的時(shí)間與次數(shù)。

水解率可間接反映肽得率大小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)可以得到較高的水解率，即海蜇腦蛋白質(zhì)所得到的肽率相對(duì)較高。若要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，就必須考慮海蜇腦蛋白質(zhì)和木瓜蛋白酶的高效利用問題，如海蜇腦蛋白質(zhì)的循環(huán)利用，如何進(jìn)一步利用未被酶解的海蜇腦蛋白質(zhì)；應(yīng)用酶的固定化技術(shù)，保持酶的催化活性，提高分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的使用期和保管期，能與反應(yīng)物和產(chǎn)物分開，有效地控制生產(chǎn)過程，并能在生產(chǎn)中反復(fù)連續(xù)使用。

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2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)正交試驗(yàn)分析得出的最優(yōu)工藝進(jìn)行了5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解率分別為51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值為52.90%，均大于正交試驗(yàn)中得到的水解率。說明該最佳工藝條件是合理的、可靠的。

3 結(jié)論與討論

通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)的最佳條件為酶用量3 000 U/g、pH為5、酶解溫度為45 ℃、酶解時(shí)間2 h，固液比為1∶4，在此條件下水解海蜇腦蛋白質(zhì)，水解率可達(dá)50.11%。

本研究在蛋白質(zhì)提取過程中使用了超聲波輔助提取法，可有效提高海蜇腦蛋白質(zhì)提取效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約成本。超聲波能將蛋白質(zhì)粉碎、液化，減少蛋白質(zhì)的變性沉淀，得到優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[17]，安全可靠，對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響較小[18]，但在提取過程中產(chǎn)生的高溫會(huì)使小部分蛋白質(zhì)變性[19]，因此在使用超聲提取法過程中應(yīng)注意超聲處理的時(shí)間與次數(shù)。

水解率可間接反映肽得率大小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)可以得到較高的水解率，即海蜇腦蛋白質(zhì)所得到的肽率相對(duì)較高。若要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，就必須考慮海蜇腦蛋白質(zhì)和木瓜蛋白酶的高效利用問題，如海蜇腦蛋白質(zhì)的循環(huán)利用，如何進(jìn)一步利用未被酶解的海蜇腦蛋白質(zhì)；應(yīng)用酶的固定化技術(shù)，保持酶的催化活性，提高分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的使用期和保管期，能與反應(yīng)物和產(chǎn)物分開，有效地控制生產(chǎn)過程，并能在生產(chǎn)中反復(fù)連續(xù)使用。

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2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)正交試驗(yàn)分析得出的最優(yōu)工藝進(jìn)行了5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解率分別為51.76%、56.17%、53.23%、49.58%、53.76%，平均值為52.90%，均大于正交試驗(yàn)中得到的水解率。說明該最佳工藝條件是合理的、可靠的。

3 結(jié)論與討論

通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)的最佳條件為酶用量3 000 U/g、pH為5、酶解溫度為45 ℃、酶解時(shí)間2 h，固液比為1∶4，在此條件下水解海蜇腦蛋白質(zhì)，水解率可達(dá)50.11%。

本研究在蛋白質(zhì)提取過程中使用了超聲波輔助提取法，可有效提高海蜇腦蛋白質(zhì)提取效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)約成本。超聲波能將蛋白質(zhì)粉碎、液化，減少蛋白質(zhì)的變性沉淀，得到優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[17]，安全可靠，對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響較小[18]，但在提取過程中產(chǎn)生的高溫會(huì)使小部分蛋白質(zhì)變性[19]，因此在使用超聲提取法過程中應(yīng)注意超聲處理的時(shí)間與次數(shù)。

水解率可間接反映肽得率大小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用木瓜蛋白酶酶解海蜇腦蛋白質(zhì)可以得到較高的水解率，即海蜇腦蛋白質(zhì)所得到的肽率相對(duì)較高。若要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，就必須考慮海蜇腦蛋白質(zhì)和木瓜蛋白酶的高效利用問題，如海蜇腦蛋白質(zhì)的循環(huán)利用，如何進(jìn)一步利用未被酶解的海蜇腦蛋白質(zhì)；應(yīng)用酶的固定化技術(shù)，保持酶的催化活性，提高分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的使用期和保管期，能與反應(yīng)物和產(chǎn)物分開，有效地控制生產(chǎn)過程，并能在生產(chǎn)中反復(fù)連續(xù)使用。

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