李 新,張舒巖,楊立彬,李 冉,蔣然然,陳治光,李樹蕾,李樹紅

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學(xué)系,四川雅安 625000;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科,吉林長(zhǎng)春 130021;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科,吉林長(zhǎng)春 130021;4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,吉林長(zhǎng)春 130021)

Raw264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的改良

李 新1,張舒巖2,楊立彬3,李 冉1,蔣然然1,陳治光1,李樹蕾4,李樹紅1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程學(xué)系,四川雅安 625000;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科,吉林長(zhǎng)春 130021;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科,吉林長(zhǎng)春 130021;4.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,吉林長(zhǎng)春 130021)

目的:通過改良細(xì)胞培養(yǎng)方案建立體外誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化形成成熟破骨細(xì)胞(OC)的高效培養(yǎng)體系。方法:向Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)液α-MEM中添加50μg·L－1M-CSF、100μg·L－1RANKL和1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3,于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)12 d,每3 d換液1次,每次換液前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短暫消化。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、FITC-phalloidin染色和免疫熒光染色鑒定OC是否成熟并具有吞噬功能。結(jié)果:通過改良培養(yǎng)方法,在誘導(dǎo)過程中培養(yǎng)孔內(nèi)的大部分區(qū)域始終保持單層細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。鏡下觀察和HE染色,誘導(dǎo)第12天時(shí)OC胞體覆蓋培養(yǎng)面積的70%;FITC-phalloidin染色,伴隨著OC成熟,偽足內(nèi)出現(xiàn)的束狀偽足小體逐漸變?yōu)榄h(huán)形,最終融合帶狀肌動(dòng)蛋白環(huán)環(huán)繞在胞質(zhì)周圍;免疫熒光染色,誘導(dǎo)12 d后OC表達(dá)的降鈣素受體(CTR)較前體細(xì)胞顯著增加, TRAP染色顯示OC胞漿內(nèi)呈現(xiàn)大量紅色顆粒。提示獲得的OC成熟并具有吞噬功能。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過改良培養(yǎng)方法,聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子50μg·L－1M-CSF、100μg·L－1RANKL和1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3建立了體外誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化形成成熟OC的高效培養(yǎng)體系。

Raw 264.7細(xì)胞;破骨細(xì)胞;巨噬細(xì)胞集落刺激因子;核因子κB受體活化因子配體;1.25二羥基維生素D3

健康成人的骨組織處于一種不斷更新和重建的狀態(tài)。骨重建是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,包括骨吸收和骨形成[1]。其中行使骨吸收功能的細(xì)胞主要是破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)[2],行使骨形成功能的細(xì)胞是成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)。正常生理?xiàng)l件下兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡,如果這種平衡被打破就會(huì)發(fā)生一系列疾病[3]。Raw264.7細(xì)胞是目前公認(rèn)的唯一成系的OC前體細(xì)胞[4],可表達(dá)OC表型的標(biāo)志基因,能形成骨吸收陷窩[5]。由于巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)在OC形成和分化過程中起關(guān)鍵作用,目前國內(nèi)外多采用M-CSF和RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化為OC,但是誘導(dǎo)效率不高;并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)Raw264.7細(xì)胞將層疊生長(zhǎng),不利于OC分化生成以及觀察,這些均是OC誘導(dǎo)亟待解決的問題。為了解決以上兩個(gè)問題,本實(shí)驗(yàn)對(duì)Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行了改良優(yōu)化。由于1α,25-(OH)2D3可直接作用于OC前體細(xì)胞,促進(jìn)OC生成并發(fā)揮骨吸收作用,也是OC形成和激活必需的因子[6],本文作者利用M-CSF、RANKL 和1α,25-(OH)2D33種細(xì)胞因子的聯(lián)合作用誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞分化為OC,同時(shí)利用低濃度胰酶短暫消化保證前體細(xì)胞始終保持單層細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),旨在建立體外誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化為成熟OC的高效培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

Raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞系購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。RANKL和M-CSF(美國R&D公司),Hochest33342、FITC-phalloidin 和1α,25-(OH)2D3(美國Sigma公司),α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒(上海哈靈生物有限公司),兔抗小鼠降鈣素受體(calcitonin receptor,CTR)抗體(北京博奧森公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(以色列Biological Industries公司),Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔(江蘇碧云天公司),其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。MC0175 CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司),IX71電腦型熒光顯微鏡和Ck40-F200倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),BCM-1000超凈工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化為OC 將1.6×104m L－1的Raw264.7細(xì)胞懸液以0.5 m L/孔接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)1 h,去除未貼壁細(xì)胞,更換新鮮α-MEM培養(yǎng)液(10%FBS、100 U·m L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素),加入M-CSF(50μg·L－1)、RANKL(100μg·L－1) 和1α,25-(OH)2D3(1×10－8mol·L－1),于5% CO2、37℃培養(yǎng)12 d,每3 d換液1次,每次換液時(shí),利用0.125%胰酶消化30 s,使培養(yǎng)孔內(nèi)的大部分區(qū)域仍保持單層細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 分別在誘導(dǎo)第2、3、6、9和12天,于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況及單個(gè)核細(xì)胞融合情況。利用IPP6.0軟件計(jì)算10個(gè)相同單位面積下單核細(xì)胞與多核細(xì)胞的面積比。

1.2.3 HE染色 分別在誘導(dǎo)第2、3、6、9和12天去除培養(yǎng)液,PBS沖洗3次后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,PBS沖洗3次,蘇木精染色液染色10 s,自來水返藍(lán)10～20 s,伊紅染色3 min,無水乙醇脫水。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 FITC-phalloidin染色 取培養(yǎng)6、9和12 d后的OC培養(yǎng)板經(jīng)PBS沖洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,PBS沖洗3次,加入FITC-phalloidin (1∶100),37℃避光孵育30 min,PBS沖洗3次, Hochest33342復(fù)染細(xì)胞核10 min,PBS沖洗3次,熒光顯微鏡下觀察OC肌動(dòng)蛋白分布。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)CTR表達(dá) 培養(yǎng)12 d后將OC培養(yǎng)板用PBS反復(fù)沖洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,PBS沖洗3次,加入0.3%Triton-X100處理20 min,5%FBS封閉30 min,加入兔抗小鼠CTR抗體(1∶100)4℃過夜;次日以PBS沖洗5次,加入Alexa-488標(biāo)記的山羊抗兔37℃孵育1 h,PBS沖洗3次,Hochest33342復(fù)染細(xì)胞核,PBS沖洗3次。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光分布范圍和熒光強(qiáng)度。

1.2.6 TRAP染色 分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第2和12天去除培養(yǎng)液,PBS沖洗3次,2.5%戊二醛固定液固定10 min,加入預(yù)熱的孵育液后于37℃孵育50 min,PBS沖洗3次,于倒置相差顯微鏡下觀察陽性顆粒的分布(TRAP染色陽性顆粒為酒紅色)。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)

在誘導(dǎo)培養(yǎng)的前2 d(圖1A),Raw264.7細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生顯著改變,從第3天開始可見少量較小的OC,細(xì)胞核數(shù)量2～3個(gè)(圖1B);第6～9天開始OC數(shù)量增多且體積逐漸增大,可見片狀偽足和絲狀突起,細(xì)胞內(nèi)可見幾個(gè)到幾十個(gè)核不等,胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡,此外還可見大量正處于融合中的細(xì)胞(圖1C和D);至第12天利用IPP6.0軟件計(jì)算10個(gè)相同單位面積下單核細(xì)胞與多核細(xì)胞的面積比,OC胞體覆蓋面積達(dá)到培養(yǎng)面積的70%(圖1E)。

圖1 倒置顯微鏡觀察M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3聯(lián)合誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞分化為OC的形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphologic changes of OC differentiated from Raw264.7 cells induced by M-CSF,RANKL,and 1α,25-(OH)2D3observed under inverted microscopeA:2 d;B:3 d;C:6 d;D:9 d;E:12 d;Bar＝50μm.A:2 d;B:3 d;C:6 d;D:9 d;E:12 d;Bar＝50μm.

2.2 HE染色觀察誘導(dǎo)的OC的形態(tài)學(xué)

培養(yǎng)2、3和6 d后隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng), Raw 264.7細(xì)胞逐漸聚集融合形成多核OC,細(xì)胞核數(shù)量逐漸增多(圖2A～C,見插頁六),培養(yǎng)9 和12 d后,Raw264.7細(xì)胞呈圓形或橢圓形,染色質(zhì)顆粒細(xì)小,分布均勻,每個(gè)核含2個(gè)核仁,胞漿內(nèi)含有空泡,可見片狀偽足,絲狀突起不清晰(圖2D和E,見插頁六)。

2.3 FITC-phalloidin染色觀察Raw264.7細(xì)胞偽足小體變化

phalloidin能特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin),故FITC-phalloidin染色后,細(xì)胞內(nèi)F-actin呈綠色熒光。伴隨著OC的分化,培養(yǎng)6 d 的OC胞質(zhì)內(nèi)可見較多F-actin束狀聚集形成偽足小體(圖3A,見插頁六),培養(yǎng)9～12 d的OC胞質(zhì)中束狀的F-actin轉(zhuǎn)變成較多小的環(huán)狀偽足小體(圖3B和C,見插頁六)。環(huán)狀偽足小體存在時(shí)間較短,很快在OC周圍融合形成相對(duì)穩(wěn)定的帶狀結(jié)構(gòu),即肌動(dòng)蛋白環(huán)(圖3B和C,見插頁六)。

2.4 免疫熒光組織化學(xué)染色觀察CTR表達(dá)

培養(yǎng)12 d的OC中CTR表達(dá)量逐漸升高,并從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜,因此細(xì)胞膜和核周細(xì)胞質(zhì)中均呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。而未成熟的OC前體細(xì)胞因CTR表達(dá)量很少,故核周少量胞質(zhì)中僅呈現(xiàn)微弱的綠色熒光。見圖4(插頁六)。

2.5 TRAP染色鑒定OC

倒置相差顯微鏡下觀察,培養(yǎng)12 d后的OC胞質(zhì)中染色酶活性部位呈紅色TRAP陽性顆粒,核周紅色顆粒較周邊胞質(zhì)多,往往掩蓋細(xì)胞核;而培養(yǎng)2 d的未成熟的OC胞質(zhì)被染成黃色,無紅色陽性顆粒。見圖5(插頁六)。

3 討論

OC屬于一種終末細(xì)胞,體外培養(yǎng)只能生存2周,且無法傳代,因此體外培養(yǎng)OC比較困難。雖然19世紀(jì)80年代Martin等從兔四肢骨中分離出OC[7],但是對(duì)OC的研究進(jìn)展仍較為緩慢。1982年Arai等[8]建立了OC體外培養(yǎng)體系,此后對(duì)OC的研究越來越廣泛。但目前OC體外培養(yǎng)方法中仍有不足,例如誘導(dǎo)效率不高、Raw264.7細(xì)胞層疊生長(zhǎng)不利于OC分化和觀察等。因此,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上問題改良了OC樣細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系,對(duì)研究OC的形成、分化、活性及功能具有重要意義。

RANKL是目前已知的唯一能夠通過受體直接作用于OC前體細(xì)胞、促進(jìn)其分化為成熟OC的細(xì)胞因子,是OC生成的最終決定因子[9]。M-CSF 與OC前體細(xì)胞上的受體c-fms結(jié)合,促進(jìn)OC前體細(xì)胞的增殖和融合[10],RANKL和M-CSF聯(lián)合應(yīng)用可不依賴于其他因子而促進(jìn)OC的形成和分化[11]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中本文作者對(duì)M-CSF和RANKL進(jìn)行濃度篩選,發(fā)現(xiàn)50μg·L－1M-CSF 和100μg·L－1RANKL聯(lián)合應(yīng)用時(shí)形成的OC數(shù)目最多(數(shù)據(jù)未顯示),所以本實(shí)驗(yàn)把M-CSF濃度設(shè)定為50μg·L－1,RANKL的濃度設(shè)定為100μg·L－1。為了進(jìn)一步提高OC的獲得效率,本文作者在M-CSF和RANKL聯(lián)合應(yīng)用基礎(chǔ)上增加了1α,25-(OH)2D3。1α,25-(OH)2D3能夠刺激OC形成和分化[12],在RANKL等的存在下可直接作用于OC前體細(xì)胞,通過加強(qiáng)RANKL的作用,促進(jìn)其生成OC并發(fā)揮骨吸收作用[13]。1α,25-(OH)2D3促進(jìn)OC的形成和分化的能力與培養(yǎng)體系中的濃度有關(guān)。1α,25-(OH)2D3的濃度為1×10－6～1×10－9mol·L－1時(shí),OC形成活躍;當(dāng)濃度為1×10－8mol·L－1時(shí),OC增殖較快,骨吸收最活躍[14]。所以本研究采用1α,25-(OH)2D3的濃度為1×10－8mol·L－1。

此外,如何有效控制細(xì)胞保持單層細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)一直是困擾OC誘導(dǎo)的難題。本研究利用OC貼壁能力強(qiáng)、不能被消化的特點(diǎn),在每次換液前用0.125%胰酶消化30 s,在OC仍貼壁的前提下,保留一定數(shù)量和密度的前體細(xì)胞,使得OC分化形成過程得以繼續(xù),并始終保持單層生長(zhǎng)狀態(tài);由于消化后上清中的細(xì)胞已經(jīng)過細(xì)胞因子誘導(dǎo)啟動(dòng)分化過程,所以將其重新接種到新的培養(yǎng)孔中,加入含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)。通過改良培養(yǎng)過程,誘導(dǎo)12 d后,培養(yǎng)孔內(nèi)的大部分區(qū)域仍保持單層細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),并且OC生長(zhǎng)面積高達(dá)培養(yǎng)面積的70%。

為了驗(yàn)證改良后的方法是否能成功誘導(dǎo)出具有功能的成熟OC,本研究從形態(tài)、標(biāo)志物和功能三方面鑒定了獲得的OC?；罴?xì)胞觀察和HE染色顯示:培養(yǎng)至第6天,聚集成團(tuán)的單核細(xì)胞逐漸融合形成多核細(xì)胞;培養(yǎng)至第9～12天時(shí),圓形或不規(guī)則形的多核細(xì)胞數(shù)量顯著增多,胞體較大,細(xì)胞核平均3～8個(gè),并且胞質(zhì)中出現(xiàn)較多空泡,提示OC已經(jīng)具有吞噬功能。形成偽足是OC成熟和執(zhí)行吞噬能力的重要結(jié)構(gòu),所以本文作者檢測(cè)了偽足小體的形成。F-actin是偽足小體和細(xì)胞骨架的主要成分之一,phalloidin能特異性結(jié)合F-actin,故本研究采用FITC-phalloidin熒光染色顯示OC的細(xì)胞輪廓以及偽足小體和肌動(dòng)蛋白環(huán)。隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),OC中偽足小體逐漸由束狀演變成環(huán)狀,最終形成帶狀的肌動(dòng)蛋白環(huán)。偽足小體的形態(tài)學(xué)變化標(biāo)志著OC的成熟[15]。OC成熟后表達(dá)特異性的標(biāo)志物CTR和具有活性的TRAP。CTR在OC前體細(xì)胞表達(dá)很弱,在成熟OC表達(dá)則顯著增加[16]。這與本研究的免疫熒光結(jié)果一致。本文作者還利用組織化學(xué)染色法檢測(cè)了OC中TRAP的活性,結(jié)果顯示:培養(yǎng)12 d的OC核周和外圍的胞質(zhì)中均有大量具有活性的TRAP。以上結(jié)果證明聯(lián)合應(yīng)用M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3成功誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化為成熟的OC。

綜上所述,本研究通過改良培養(yǎng)方法,建立聯(lián)合應(yīng)用M-CSF(50μg·L－1)、RANKL (100μg·L－1)和1α,25-(OH)2D3(1× 10－8mol·L－1)體外誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞分化形成成熟OC的高效培養(yǎng)體系。

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Improved induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into osteoclasts

LI Xin1,ZHANG Shu-yan2,YANG Li-bin3,JIANG Ran-ran1,CHEN Zhi-guang1, LI Ran1,LI Shu-lei4,LI Shu-hong1
(1.Department of Agricultural Product Processing and Storage,Food Institute,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625000,China;2.Department of Neurosurgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;3.Department of Pediatrics,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 4.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences, Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo establish a high-performance induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into osteoclasts(OC)in vitro by improving the cell culture program.MethodsThe Raw264.7 cells were cultured withα-MEM medium containing 50μg·L－1M-CSF,100μg·L－1RANKL,and 1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3in 5%CO2for 12 d at 37℃.The cells were digested transiently every time before the medium was changed after every three days.The morphologic changes of the Raw264.7 cells were observed by inverted microscope.The maturation and phagotrophic function of OC were identified by HE,TRAP,FITC-phalloidin staining and immunofluorescence.ResultsThe cells remained to grow in single layers all the time in most areas of the well during the whole induction by the improved culture program.The observation results of inverted microscope and HE staining showed that the growth area of the polykaryotic OC reached to 70%of the well on day 12.FITC-phalloidin staining showed that in the maturation of the OC,the cluster-shaped podosomes in the pseudopodia gradually transformed into rings,which finally fused to form a large belt surrounding the periphery of the cytoplasm.The calcitionin receptor(CTR)expressed by OC was markedly enhanced compared with the precursor cells by immunofluroescence staining,and a large number of red granules appeared in the cytoplasm of OC with TRAP staining on day 12.These results comfirmed that the obtained OC were maturated and owned phagotrophic function.ConclusionA high-performance induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into OC in vitro induced by combination of 50μg·L－1M-CSF,100μg·L－1RANKL,and 1× 10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3is established by improving the cell culture program.

Raw264.7 cell;osteoclast;macrophage colony-stimulating factor;receptor activator for nuclear factor-κB ligand;1α,25-dihydroxyvitamin D3

R494.26;Q813.1

A

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金資助課題(31101249)

李 新(1988－),女,吉林省松原市人,在讀醫(yī)學(xué)碩士,主要從事胱氨酸蛋白酶抑制劑的純化鑒定及生理作用研究。

李樹紅(Tel:0835-2882311,E-mail:xiaoshu.928＠126.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1114-05

10.13481/j.1671-587x.20140540