陳志華,林素勇,陳紹勤,戴起寶,韓宏景

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科,福建福州 350005)

結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化對其表達水平的影響及其臨床意義

陳志華,林素勇,陳紹勤,戴起寶,韓宏景

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科,福建福州 350005)

目的:研究結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)對Kiss-1基因表達的影響,分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特性的關(guān)系及臨床意義。方法:收集126例結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常結(jié)直腸組織,采用甲基化特異性PCR(MSP)檢測Kiss-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),采用實時熒光定量PCR和Western blotting法檢測結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中Kiss-1基因mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果:結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率(83.33%)高于癌旁正常結(jié)直腸組織(30.16%)(P＜0.05)。結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性組Kiss-1基因mRNA和蛋白表達水平均低于Kiss-1基因啟動子甲基化陰性組(P＜0.05)。結(jié)直腸癌組織中T3＋T4組Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率高于T1＋T2組(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA和蛋白表達水平低于T1＋T2組(P＜0.05);中和低分化組Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率高于高分化組(P＜0.05), Kiss-1基因m RNA表達水平低于高分化組(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組甲基化陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA及蛋白表達水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05);遠處轉(zhuǎn)移組Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率顯著高于無遠處轉(zhuǎn)移組(P＜0.05),但Kiss-1基因m RNA及蛋白表達水平低于無轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率與患者的性別、年齡、腫瘤部位和大小無明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。結(jié)論:結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化與Kiss-1基因表達水平及結(jié)直腸癌的惡性轉(zhuǎn)化特性(特別是轉(zhuǎn)移)有關(guān)聯(lián),Kiss-1基因甲基化狀態(tài)有望成為評估結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險的重要指標(biāo)。

結(jié)直腸腫瘤;Kiss-1基因;DNA甲基化;轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率有逐年上升趨勢。雖然各種綜合治療手段不斷發(fā)展,但總體生存率依舊欠佳,其原因主要是遠處轉(zhuǎn)移高發(fā)生率以及腫瘤局部高復(fù)發(fā)率,因此抑制和治療結(jié)直腸癌遠處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后重要因素。Kiss-1基因是新近發(fā)現(xiàn)的重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,研究[1-2]證實:Kiss-1基因具有抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用,同時發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)直腸癌的惡性演進, Kiss-1基因表達呈現(xiàn)不斷下調(diào)的現(xiàn)象,但其原因尚不明確。Cebrian等[3]發(fā)現(xiàn):在膀胱癌組織中Kiss-1基因Cp G島存在異常甲基化,與患者的預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)。但在結(jié)直腸癌中Kiss-1基因是否存在異常甲基化、是否與Kiss-1在結(jié)直腸癌惡性演進過程中表達缺失有關(guān)等,目前暫未見相關(guān)報道。本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因甲基化水平,分析其對Kiss-1基因表達的影響,探討Kiss-1基因甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌臨床病理特性的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料和主要試劑收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科2011年4月—2012年3月手術(shù)切除的126例新鮮結(jié)直腸癌瘤體及距瘤體10 cm以上的正常結(jié)直腸組織標(biāo)本,液氮保存。入選病例術(shù)前均經(jīng)病理確診且未經(jīng)化療和放療。年齡15～88歲,平均年齡(58.64±10.75)歲;其中男性65例,女性61例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例;遠處轉(zhuǎn)移11例。主要試劑:DNA提取試劑盒和蛋白酶K購于北京白泰克公司, Na HSO3和C6H4(OH)2購于美國Sigma公司, Wizard DNA Clean-Up System試劑盒購于美國Promega公司,實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒購于美國Invitrogen公司,Kiss-1多克隆杭體購于美國Santa-Cruz公司。Kiss-1基因引物參照文獻[4]設(shè)計,由上海生物技術(shù)工程有限公司合成。見表1。

1.2 甲基化特異PCR①基因組DNA提取:取組織0.3～0.5 cm3液氮研磨,按照說明書步驟提取基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度,測定260和280 nm處吸光度(A)值,A260/A280為1.8～2.0時DNA純度最佳。②DNA修飾及純化:取2μg DNA加入dd H2O達總體積為50μL,加入3 mol·L－1NaOH,使其終濃度為0.3 mol·L－1,42℃變性30 min,同時新鮮配制10 mmol·L－1對苯二酚及3 mol·L－1亞硫酸氫鈉,調(diào)其p H值至5.0。變性后DNA樣品中加30μL對苯二酚和520μL亞硫酸氫鈉,覆蓋礦物油,50℃避光水浴16 h。修飾后Wizard DNA Clean-Up System試劑盒純化,回收DNA并溶于20μL滅菌去離子水,－20℃保存。③甲基化特異性PCR:反應(yīng)體系25μL,分別為修飾后DNA 3μL,10×Taq Buffer 2μL, 10 mmol·L－1d NTP 0.5μL,25 mmol·L－1MgCl21.5μL,上、下游引物各1μL,Taq酶0.2μL,dd H2O 15.8μL;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃、30 s,58℃、30 s,72℃、30 s,共35個循環(huán);72℃延伸7 min。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入6×上樣緩沖液2μL,于2%瓊脂糖凝膠上電泳。在每批PCR擴增均設(shè)置甲基化陽性對照(Cp G甲基化酶修飾后新鮮胎盤組織DNA為模板)、甲基化陰性對照(胎盤組織DNA為模板)和空白對照組(H2O為模板)。結(jié)果判斷:Kiss-1基因甲基化特異性引物M有特異產(chǎn)物,而特異性引物U無產(chǎn)物,判斷為純合型甲基化陽性;如果2個都有特異產(chǎn)物,判斷為雜合型甲基化陽性;如果U擴展出特異產(chǎn)物,而M無產(chǎn)物,判斷為甲基化陰性;如果兩者均無特異產(chǎn)物為實驗失敗,重做。

表1 Kiss-1基因甲基化特異PCR引物及Real-time PCR引物序列Tab.1 Methylation-specific PCR primers and Real-time PCR primers for Kiss-1

1.3 Real-time PCR應(yīng)用Trizol提取組織RNA,用紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度,取A260/A280比值為1.8～2.1的樣品,按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,－20℃保存。反應(yīng)體系20μL (cDNA 2μL,10μmol·L－1上下游引物各1μL, 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10μL,25 mmol·L－1Mg2＋4μL,dd H2O 2 μL)。反應(yīng)程序:95℃、30 s,95℃、5 s,60℃、31 s,40個循環(huán)。用ABI7500 Real-time PCR反應(yīng)儀檢測Kiss-1 m RNA及內(nèi)參基因β-actin的擴增情況。各cDNA 5倍稀釋是最佳模板濃度,溶解曲線示Kiss-1基因PCR產(chǎn)物熔解度峰值在85.0℃,溶解溫度均一,峰形狀銳利,提示擴增出高特異性產(chǎn)物(圖1)。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔。取3份正常結(jié)直腸組織總RNA等體積混合作為正常對照樣品。用相對定量方法計算Kiss-1基因m RNA的表達量。公式:RQ＝2－△△Ct,△△Ct＝△Ct待測－△Ct正常＝(Ct待測－Ctβ-actin)－(Ct正常－Ctβ-actin)。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測提取總蛋白,考馬斯亮藍法測定濃度,以150μg總蛋白上樣,進行SDS-PAGE(5%濃縮膠,15%分離膠)分離電泳,溴酚蘭到達分離膠底部時終止電泳。100 V轉(zhuǎn)膜2 h,使蛋白轉(zhuǎn)移至0.1 nm的NC膜上,常溫封閉非特異性抗原2 h,TBST浸洗,加入一抗(1∶200鼠抗人Kiss-1單克隆抗體), 4℃孵育過夜。TBST浸洗,加入二抗(1∶500羊抗兔IgG),4℃孵育過夜。TBST浸洗后滅菌純化水漂洗后輕輕甩干。按照說明書進行顯影曝光,顯色后觀察,采用化學(xué)發(fā)光法和GIS1000軟件分析系統(tǒng)量化分析。蛋白表達量＝Kiss-1灰度值/ β-actin灰度值。

圖1 Kiss-1基因Real-time PCR產(chǎn)物溶解曲線Fig.1 Dissolution profile of Real-time PCR product of Kiss-1 gene

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。Kiss-1基因m RNA和蛋白表達水平以±s表示,組間比較采用t檢驗;Kiss-1基因甲基化陽性率與患者臨床病理特征關(guān)系的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Kiss-1基因啟動子甲基化檢測經(jīng)Kiss-1基因啟動子甲基化特異引物PCR擴增后特異性片段見圖2。結(jié)直腸癌組織為Kiss-1基因啟動子甲基化陽性,正常組織為陰性。

圖2 Kiss-1基因甲基化特異PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of specific PCR product of Kiss-1 gene methylationM:DNA markerⅠ;Lane 1,2:MSP and Un-MSP primer products of tumor A;Lane 3,4:MSP and Un-MSP primer product of normal A; Lane 5,6:MSP Un-MSP primer products of tumor B;Lane 7,8:MSP and Un-MSP primer products of normal B.

2.2 Kiss-1基因啟動子甲基化與Kiss-1基因m RNA和蛋白表達水平的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性組Kiss-1基因m RNA表達水平(0.231±0.048)顯著低于Kiss-1基因啟動子甲基化陰性組(1.214±0.209) (t＝8.12,P＜0.05)。結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性組Kiss-1基因蛋白表達水平(0.388±0.032)顯著低于Kiss-1基因啟動子甲基化陰性組(0.945±0.050)(t＝7.66,P＜0.05)。見圖3。

圖3 Western blotting法檢測結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophonegram of Kiss-1 gene protein expression in colorectal carcinoma tissue detected by Western blotting methodLane 1－6:Coloectal carcinoma tissue 1－6.

2.3 不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌患者Kiss-1基因m RNA表達水平結(jié)直腸癌組織中T3＋T4組Kiss-1基因mRNA表達水平低于T1＋T2組,中和低分化組低于高分化組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,遠處轉(zhuǎn)移組低于無遠處轉(zhuǎn)移組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);但Kiss-1基因m RNA表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小和部位無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。見表2。

2.4 不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌患者Kiss-1基因蛋白表達水平結(jié)直腸癌組織中T3＋T4組Kiss-1基因蛋白表達水平明顯低于T1＋T2組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,遠處轉(zhuǎn)移組明顯低于無遠處轉(zhuǎn)移組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);高分化組Kiss-1基因蛋白表達水平略高于中和低分化組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Kiss-1基因蛋白表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小和部位無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。見表2。

2.5 不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌患者Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因甲基化陽性率(83.33%)高于正常結(jié)直腸組織(30.16%)(P＜0.05);結(jié)直腸癌患者T3＋T4 組Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率高于T1＋T2 組,中和低分化組高于高分化組,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,遠處轉(zhuǎn)移組顯著高于無遠處轉(zhuǎn)移組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),但Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率與患者的性別、年齡、腫瘤大小及部位無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。見表2。

3 討論

DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)修飾之一,在維持染色體結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因印記和腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化,將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位碳原子上加一個甲基基團,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學(xué)修飾過程,由于這種甲基化是發(fā)生在DNA復(fù)制之后,未改變基因的堿基序列,但可以通過影響基因的表達改變其功能。

正常組織中甲基化發(fā)生率很低,但在惡性腫瘤中卻發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤相關(guān)基因的啟動子區(qū)Cp G島發(fā)生了異常甲基化,包括抑癌基因(p16、p15、p14、p73、APC和WTX)[5]、DNA修復(fù)基因(h MLH1、GSTP1和MGMT)、細胞黏附相關(guān)基因(CDH1和CDH13)、解毒控制基因(GSTP1)和凋亡控制相關(guān)基因(DAPK)等,其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。在結(jié)直腸癌中同樣發(fā)現(xiàn)了許多抑癌基因異常甲基化[6],導(dǎo)致了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展,如MLH1、APC、MGMT、RASSF1A和p16等基因均發(fā)現(xiàn)Cp G島異常甲基化現(xiàn)象,導(dǎo)致基因表達降低,從而不能在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、血管形成等方面發(fā)揮重要功能,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[7-8]。國內(nèi)外研究[9-13]表明:Kiss-1基因表達缺失與胃癌、腦轉(zhuǎn)移腫瘤、膀胱癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性相關(guān),在結(jié)直腸癌中Kiss-1基因也發(fā)揮著重要的作用。Yamashita等[4]應(yīng)用MSP方法在胃癌組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率為80%。Cebrian等[3]研究發(fā)現(xiàn):膀胱癌組織中Kiss-1基因啟動子Cp G島甲基化陽性率為83.1%,且甲基化陽性組Kiss-1基因表達量明顯低于甲基化陰性組(P＝0.037),Kiss-1基因啟動子甲基化水平與其表達水平密切相關(guān),推測Kiss-1基因啟動子異常甲基化可能導(dǎo)致Kiss-1基因表達下降,從而促進膀胱癌浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生,導(dǎo)致不良預(yù)后。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率和Kiss-1基因m RNA及蛋白表達水平Tab.2 Positive rates of Kiss-1 gene methylation and expression levels of Kiss-1 mRNA and protein in patients with different clinicopathological characteristics

本研究結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率高達83.33%,與Cebrian等[3]報道結(jié)果相近。同時發(fā)現(xiàn)Kiss-1基因甲基化陽性率與Kiss-1基因m RNA和蛋白表達水平有關(guān)聯(lián),甲基化陽性患者Kiss-1基因表達水平明顯減低,與有關(guān)胃癌[4]、膀胱癌[1]等其他惡性腫瘤的文獻報道結(jié)果一致;Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率和Kiss-1基因m RNA、蛋白表達水平均與結(jié)直腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。Kiss-1基因m RNA和蛋白表達水平也隨著腫瘤的浸潤深度進展和轉(zhuǎn)移發(fā)生而減低,本研究結(jié)果與Okugawa等[14]報道結(jié)果一致。本文作者推測: Kiss-1基因啟動子甲基化的發(fā)生可能導(dǎo)致Kiss-1基因表達的沉默,影響結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性。Moya等[15]研究發(fā)現(xiàn):Kiss-1基因甲基化可能與結(jié)直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述,結(jié)直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子異常甲基化的現(xiàn)象,可能導(dǎo)致Kiss-1基因的表達水平下調(diào),促進了結(jié)直腸癌的惡性演進過程,因此Kiss-1基因甲基化水平有可能成為評估結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險的指標(biāo)之一,通過檢測結(jié)直腸癌Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率及其表達水平,可以早期預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險。同時,基因異常甲基化是一種可逆的過程,通過藥物或遺傳學(xué)處理去甲基化可導(dǎo)致基因重新表達,通過逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌中Kiss-1基因甲基化狀態(tài)有可能提高Kiss-1基因的表達水平[16],進而降低結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的潛能,這為預(yù)防和治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供了新思路,但有待進一步研究證實。

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Effect of Kiss-1 gene promoter methylation on its expression in colorectal carcinoma tissue and its clinical significance

CHEN Zhi-hua,LIN Su-yong,CHEN Shao-qin,DAI Qi-bao,HAN Hong-jing
(Department of Gastrointestinal Surgery,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University, Fuzhou 350005,China)

ObjectiveTo research the effect of the Kiss-1 gene promoter methylation on the Kiss-1 gene expression in colorectal carcinoma tissue,and to analyze the relationship between the Kiss-1 gene methylation and the clinical pathological features of colorectal carcinoma and its clinical significance.MethodsThe Kiss-1 gene promotor region methylation,Kiss-1 gene m RNA and protein expressions were detected respectively by methylation-specific PCR, Real-time PCR and Western blotting method in 126 cases of colorectal carcinoma tissue and para-cacinoma normal colorectal tissue.ResultsThe positive rate of Kiss-1 gene methylation in colorectal carcinoma tissue(83.33%)was significantly higher than that in normal tissue(30.16%)(P＜0.05).In the cancer tissue,the expression levels of Kiss-1 gene m RNA and protein in Kiss-1 gene promoter methylation positive group was lower than that in Kiss-1 gene promoter methylation negative group(P＜0.05).The positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation in T3＋T4 stage group was higher than that in T1＋T2 stage group(P＜0.05),but the Kiss-1 gene m RNA and protein expression levels were lower than those in T1＋T2 stage group(P＜0.05).In the poorly and moderately differentiated group,the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation was higher than that in well differentiated group(P＜0.05),but the mRNA expression level of Kiss-1 gene was lower than that in well differentiated group(P＜0.05).In lymph node metastasis group,the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation was higher than that in lymph node negative group(P＜0.05),but the m RNA and protein expression levels were lower than those in lymph node negative group(P＜0.05).And the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation in distant metastasis group was higher than that in non-distant metastasis group(P＜0.05), but the m RNA and protein expressions levels were lower than those in non-distant metastasis group(P＜0.05).There were no significant associations between the positive rate of Kiss-1 gene promoter methylation and the gender, age,tumor location,and tumor diameter of the patients(P＞0.05).ConclusionThe Kiss-1 gene promoter methylation in colorectal carcinoma tissue is associated with the Kiss-1 gene expression level and the malignant characteristics of colorectal carcinoma;Kiss-1 gene promoter methylation may be used as a reference indicator for predicting the risk of metastasis of colorectal carcinoma.

colorectal neoplasms;Kiss-1 gene;DNA methylation;metastasis

R735.3

A

2013-11-17

國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目資助課題(2014);福建省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(2013J01291)

陳志華(1986－),男,福建省福州市人,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事胃腸道腫瘤外科基礎(chǔ)和臨床研究。

陳紹勤(Tel:0591-87982082,E-mail:chenshaoqin＠m(xù)edmail.com.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-1074-06

10.13481/j.1671-587x.20140532