吳小瓊，張賢，薛偉，劉新華

(1.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 安順 561000;2.貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

新型香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物的合成及其抗腫瘤活性*

吳小瓊1，張賢2，薛偉2，劉新華2

(1.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 安順 561000;2.貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

以3-乙?；?6-香豆素為起始原料，設(shè)計(jì)并合成了一系列新型香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和元素分析表征。初步體外生物活性測定結(jié)果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氫吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氫吡唑(6f)對癌細(xì)胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有較高的抑制增殖活性。用改進(jìn)的TRAP法測試了6a，6e和6f的端粒酶活性，其中6f具有很強(qiáng)的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。

香豆素;二氫吡唑;藥物設(shè)計(jì);合成;抗癌活性;端粒酶活性

端粒酶是一種腫瘤標(biāo)志物，已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點(diǎn)［1-2］。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的催化亞甲基，這種催化酶是端粒酶活性的關(guān)鍵。目前，靶向端粒酶的抗腫瘤治療有兩種策略:一是直接通過抑制端粒酶的催化亞基活性(hTERT)或其RNA模板，從而抑制端粒酶活性。另一種是間接抑制端粒酶亞單位與G-四鏈體穩(wěn)定劑，端粒聚合酶或HSP90抑制劑的結(jié)合［3-4］。最近，一些優(yōu)良抗癌效果的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑被報(bào)道，如BIBR15324，但這些抑制劑的選擇性不高，對人體正常細(xì)胞毒性較大。因此，發(fā)現(xiàn)并合成高效、高選擇性端粒酶抑制劑是抗癌藥物發(fā)展的迫切需要。

3，4-二氫吡唑衍生物具有多種生物活性［5-7］。本課題組曾報(bào)道［8］過類似化合物的合成及其抗腫瘤活性，尤其是基于端粒酶靶標(biāo)的新型3，4-二氫吡唑衍生物的設(shè)計(jì)、合成及構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果表明:當(dāng)在3，4-二氫吡唑骨架上接入香豆素基團(tuán)時(shí)可得到具有更高抗腫瘤活性的化合物。

本課題組通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選，已經(jīng)確定了高電子密度的香豆素環(huán)上方的活性空間。與此同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一種基于hTERT(3DU6)晶體結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。由于得到了結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)信息，可以利用分子模擬與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)相結(jié)合指導(dǎo)目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)，以便更有效地進(jìn)行綁定，從而增加藥物的效力。為此，對計(jì)算機(jī)生成二氫吡唑香豆素硫代乙酮與hTERT的活性位點(diǎn)的分子對接模型進(jìn)行了分析。引入三氟甲基便形成一個(gè)鹵鍵，苯基二氫吡唑環(huán)固定到一個(gè)更穩(wěn)定的疏水區(qū)，加強(qiáng)了端粒酶抑制活性。我們也注意到活性位點(diǎn)附近的親水性作用的重要性，以及該基團(tuán)的關(guān)鍵位置(硫酮)在溶劑的暴露區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)，芳香環(huán)的平面疏水基團(tuán)可以結(jié)合的疏水性空腔的面積，所以，在設(shè)計(jì)中用帶環(huán)的化合物作為S部分的取代基團(tuán)?；谝陨戏治?，且少有文獻(xiàn)系統(tǒng)報(bào)道上述骨架的設(shè)計(jì)合成，為了尋找并發(fā)現(xiàn)新的具有抗癌活性高效端粒酶抑制劑，本文設(shè)計(jì)并合成了一系列新型三氟甲基苯基硫代乙酮二氫吡唑香豆素。

本文以3-乙?；?6-香豆素(1)為起始原料，與2-三氟甲基苯(2a)［或苯(2f)］經(jīng)克萊森縮合反應(yīng)制得6-氯香豆素-取代苯基-α，β-不飽和酮(3a，3f);3與硫醇經(jīng)SN2反應(yīng)制得3-［1-(2-溴乙?；?-5-取代苯基-4，5-二氫吡唑-6-氯香豆素(4a，4f);4與取代硫醇(5a～5g)經(jīng)取代反應(yīng)合成了7個(gè)新型的香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和元素分析表征。測定了6a～6g對SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的體外抗腫瘤活性。并用改進(jìn)的TRAP法測試了6a，6e和6f的端粒酶活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正);400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Elementar Vario-III型元素分析儀;BioRad 550型酶標(biāo)儀。

1，3和4參考文獻(xiàn)［8］方法合成;其余所用試劑均為分析純。

1.2 6a～6g的合成(以6a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4a 10 mmol和氯仿20 mL，攪拌使其溶解;加入叔丁基硫醇(5a)10 mmol，KHCO38 mmol和催化劑KI 0.1 g，于40℃～50℃反應(yīng)3 h。冷卻至室溫，加少量水，靜置沉淀;過濾，濾餅經(jīng)二氧化硅柱色譜［洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=68∶1］純化得無色晶體6a。

用類似的方法合成無色晶體6b～6g。

6a:收率75%，m.p.176℃～177℃;1H NMR δ:0.88(t，J=8.0 Hz，3H，CH3)，1.32(m，2H，CH2in Bu)，1.55(m，2H，CH2in Bu)，2.67(t，J=4.0 Hz，2H，6-H)，3.17(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.77(m，2H，6-H)，3.93 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.75 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.17～7.58(m，7H，ArH)，8.65(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H22N2O3SF3Cl:C 57.42，H 4.24，N 5.36;found C 57.75，H 3.93，N 5.69。

6b:收率68%，m.p.143℃～145℃;1H NMR δ:3.18(dd，J=4.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Ha)，3.75～3.90(m，2H，6-H)，4.00(dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.85(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.30～6.47(m，2H，3″，4″-H)，7.22～7.60(m，8H，ArH，5″-H)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H16N2O4SF3Cl:C 57.09，H 3.32，N 5.12;found C 56.71，H 3.29，N 5.40。

6c:收率77%，m.p.147℃～148℃;1H NMR δ:3.12(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.92(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.18～4.49(m，2H，6-H)，5.72(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.10(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，7.28～7.46(m，9H，ArH)，7.71(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H); Anal.calcd for C27H17N2O3SF3ClBr:C 52.15，H 2.76，N 4.50;found C 51.87，H 3.03，N 4.81。

6d:收率69%，m.p.150℃～151℃;1H NMR δ:3.16(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=18.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.09～4.34(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.11～7.71(m，10H，ArH)，8.00(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C27H17N3O5SF3Cl:C 55.16，H 2.91，N 7.15;found C 54.87;H 3.09，N 7.48。

6e:收率63%，m.p.165℃～167℃;1H NMR δ:3.15(dd，J=18.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.33～4.79 (m，2H，6-H)，5.77(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz， 1H，5-H)，7.16～7.47(m，7H，ArH)，7.85(d，J=4.0 Hz，1H，ArH)，8.69(d，3H，4'-H，Py-H);Anal.calcd for C25H16N4O3SF3Cl:C 55.10，H 2.96，N 10.28;found C 55.35，H 3.14，N 9.89。

6f:收率72%，m.p.175℃～176℃;1H NMR δ:0.90(t，J=8.0 Hz，3H，CH3in Pr)，1.61～2.53(m，4H，CH2in Pr)，3.15(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.70(m，2H，6-H)，3.87 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.71 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.09～7.35(m，8H，ArH)，8.64(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C23H21N2O3SCl:C 62.65，H 4.80，N 6.35;found C 63.02，H 5.11，N 5.95。

6g:收率67%，m.p.149℃～151℃;1H NMR δ:3.13(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.90(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.10～4.43(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.97～7.41(m，13H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C26H19N2O3SCl:C 65.75，H 4.03，N 5.90;found C 66.01，H 4.27，N 5.62。

1.3 活性測試

［8］方法測定6a～6g和5-Fu的抗癌活性和端粒酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗癌活性

以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照，考察了6a～6f對SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的細(xì)胞毒活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可見，6a和6f對SGC-7901和MGC-803表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性，而且超過了5-Fu的細(xì)胞毒活性。6f對Bcap-37抗癌活性也要比5-Fu強(qiáng)，其IC50為(4.59±0.77)μM。

從表1的活性數(shù)據(jù)可以得出以下結(jié)論:6a～6g可以分為兩類，即在硫原子的末端含有直鏈取代基化合物(6a，6f)和環(huán)狀取代的化合物(6b，6c，6d)，其中6a和6f對SGC-7901，HepG-2，Bcap-37和MGC-803細(xì)胞系表現(xiàn)出較為明顯的抗癌活性，而大多數(shù)其它環(huán)狀取代基團(tuán)的化合物對上述細(xì)胞系只表現(xiàn)出中強(qiáng)度的抗癌活性。

表1 6a～6g的體外抗癌活性aTab le 1 Anticancer activities of 6a～6g in vitro

表2 6a，6e和6f對端粒酶抑制活性Table 2 The inhibitory activities of 6a，6e and 6f on telomerase

2.2 端粒酶活性

以MGC-803為研究對象，從中提取出了端粒酶，并選用溴化乙錠和BIBR1532作為對照測試了6a，6e和6f對端粒酶的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可見，6f對端粒酶表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。表1和表2數(shù)據(jù)表明:6f的抗增殖活性和端粒酶活性之間具有良好的相關(guān)性，初步說明6f是通過抑制端粒酶而抑制癌細(xì)胞生長的，表現(xiàn)出比其它化合物更高的抑制活性。三氟甲基可能具有局部偶極矩匹配結(jié)合的位點(diǎn)，使偶極矩的方向相反，導(dǎo)致較高的活性。這也為我們進(jìn)一步優(yōu)化具有抗癌活性以作為潛在的端粒酶抑制劑的二氫吡唑結(jié)構(gòu)指出了方向。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)并合成了7個(gè)新型的香豆素二氫吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)。初步體外生物活性測定結(jié)果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氫吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氫吡唑(6f)對癌細(xì)胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有較高的抑制增殖活性。6f對端粒酶具有很強(qiáng)的抑制活性，其IC50為(1.27±0.18)μM。

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［7］白林山，劉會(huì)峰，劉新華.新型色酮衍生物的設(shè)計(jì)合成與抗癌活性［J］.合成化學(xué)，2010，18(6): 671-674.

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Synthesis and Anticancer Activities of Novel Coumarin-dihydropyrazole Thio-ethanone Derivatives

WU Xiao-qiong1，ZHANG Xian2，XUEWei2，LIU Xin-hua2
(1.Anshun Professional Technology Institute，Anshun 561000，China; 2.Center for Research and Development of Fine Chemicals，Guizhou University，Guiyang 550025，China)

A series novel coumarin-dihydropyrazole thio-ethanone derivativeswere designed and synthesized from 3-acetyl-6-coumarin.The structureswere characterized by1H NMR and elemental analysis.The preliminary in vitro biological activities tests showed that［(butylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6a)and［(propylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6f)exhibited high anticancer activities against SGC-7901，MGC-803，Bcap-37 and HepG-2 cell lines.6a，6e and 6f were tested against telomerase by a modified TRAP assay and 6f showed themost potent inhibitory activity with IC50value of(1.27±0.18)μM.

coumarin;dihydropyrazole;drug molecular design;synthesis;anticancer activity;telomerase activity

O621.3;R914.5

A

1005-1511(2014)02-0164-04

2013-09-09;

2013-11-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21272008)

吳小瓊(1967-)，女，漢族，貴州安順人，副教授，主要從事有機(jī)化學(xué)的研究。

劉新華，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:xhliuhx@163.com