龔志剛，張?jiān)賯?，姜其鈞，丁世芳

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東廣州 510515；2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430070；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

蝦青素預(yù)處理對(duì)體外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

龔志剛1，2，張?jiān)賯?，姜其鈞2，丁世芳2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東廣州 510515；2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430070；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

目的探討蝦青素對(duì)體外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、模型組(叔丁基過氧化氫100μmol/L)、蝦青素+叔丁基過氧化氫(蝦青素0.1、1、10 nmol/L預(yù)處理24 h后，再加終濃度為100μmol/L的叔丁基過氧化氫溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h)組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；DAPI染細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平；比色法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)活性；JC-1法測(cè)定線粒體膜電位。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，叔丁基過氧化氫(100μmol/L)能明顯造成內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。蝦青素可降低叔丁基過氧化氫引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.05)，線粒體膜電位增加，Caspase3表達(dá)減弱。結(jié)論蝦青素對(duì)叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與保護(hù)線粒體功能有關(guān)。

氧化應(yīng)激；內(nèi)皮祖細(xì)胞；蝦青素；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成人最重要的一組調(diào)節(jié)血管新生和形成血管內(nèi)皮的祖細(xì)胞，其在外周循環(huán)血中的數(shù)量與功能是促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，進(jìn)行再內(nèi)皮化，維持其完整的重要因素［1］。

近年來的研究表明，EPCs對(duì)氧化應(yīng)激損傷敏感［2］；臨床觀察也證實(shí)，冠心病的危險(xiǎn)因素如吸煙、高氧化低密度脂蛋白血癥、高血壓、糖尿病，缺血再灌注損傷、經(jīng)皮冠脈介入治療損傷［3］。由此引起內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷和凋亡的，可能是患者外周血EPCs的數(shù)量及功能受損的直接原因。因此，增強(qiáng)EPCs抗氧化應(yīng)激能力，降低凋亡的發(fā)生，改善其功能，可能是血管損傷后再內(nèi)皮化治療的新靶點(diǎn)［4］。

蝦青素(astaxanthin，ASX)是雨生紅球藻在受到環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞為抵御不良環(huán)境而形成的應(yīng)激機(jī)制中的一種分子，對(duì)氧化應(yīng)激引起的多種細(xì)胞，如人神經(jīng)干細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等的凋亡具有顯著保護(hù)作用［5-8］。但ASX對(duì)EPCs是否抗氧化應(yīng)激損傷引起凋亡，目前尚未見報(bào)道。

本研究利用體外培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞源的EPCs，叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)干預(yù)EPCs制作氧化應(yīng)激損傷模型，觀察ASX對(duì)t BHP誘導(dǎo)EPCs凋亡的保護(hù)作用，探討ASX對(duì)人EPCs的抗凋亡功能及可能機(jī)制，為深入研究ASX的心血管保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物及試劑Histopaque1077淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Amersham Biosciences公司)；M199培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Gibico公司)；胰酶(上海博光生物技術(shù)公司)；硫氰酸熒光標(biāo)記荊豆凝集

素I(FITC-UEA-I)、人纖維連接蛋白、ASX、tBHP、MTT(甲基噻唑藍(lán))(美國(guó)Sigma公司)；乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)(美國(guó)Molecular Probe公司)；重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(rh-VEGF165)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rh-b-FGF)(英國(guó)Pepro Tech公司)；PE標(biāo)記鼠抗人CD133單克隆抗體(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)；FITC標(biāo)記鼠抗人CD34單克隆抗體(美國(guó)Southern Biotech公司)；PE標(biāo)記鼠抗人VEGF-R2單克隆抗體、Caspases活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D System公司)；ROS檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、DAPI Apoptosis Detection試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 人內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定取健康志愿者外周血，以1∶2比例的PBS稀釋后，緩慢移至Histopaque1077淋巴細(xì)胞分離液上方，400×g室溫離心30 min，分離出中間單個(gè)核細(xì)胞層。將分離好的單核細(xì)胞用含有100 m L/L PBS、200 m L/L胎牛血清、rh-VEGF 10 ng/m L、rh-b-FGF 10 ng/m L的M199培養(yǎng)液稀釋成5×106/m L，放置于37℃、50 m L/L CO2孵箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)到第4天，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；取第7天的細(xì)胞，加入2.4 mg/L DiI-Ac-LDL和10 mg/L FITC-UEA-I于37℃孵育1h后，用熒光顯微鏡檢測(cè)雙染色陽性細(xì)胞百分比。另取第7天的細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，分別加入10 mg/L PE標(biāo)記的VEGF-R2單克隆抗體、10 mg/L PE標(biāo)記的CD133單克隆抗體、10 mg/L FITC標(biāo)記的CD34抗體，4℃孵育30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率。于第7天加入無血清的培養(yǎng)液同步化細(xì)胞24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 人內(nèi)皮祖細(xì)胞tBHP損傷模型的建立同步化后的EPCs用2.5 g/L胰酶消化，以1×103/孔的密度接種于96孔板，分別加入濃度為30、60、120、240 μmol/L的tBHP干預(yù)6 h，加入10μL MTT(5 g/L)在37℃孵育4 h后吸去上清，加入100μL二甲基亞砜，振蕩10 min溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)值。根據(jù)細(xì)胞存活情況選擇合適的tBHP作用濃度用于后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值)×100%

1.4 ASX對(duì)正常和損傷細(xì)胞存活率的影響待細(xì)胞長(zhǎng)到鋪滿板底70%～80%時(shí)，加入終濃度分別為0.1、1、10 nmol/L的ASX溶液，于37℃孵育24 h后換為無血清MEM，再加終濃度為100μmol/L的tBHP溶液繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定藥物處理好的細(xì)胞除去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，binding buffer重懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/m L，然后用40 g/L的多聚甲醛固定15 min，用DAPI(2.5μg/m L)染核20 min，在熒光顯微鏡下拍攝細(xì)胞圖像觀察細(xì)胞核形態(tài)。熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，核出現(xiàn)不同程度的固縮，可見DNA熒光碎片(凋亡小體)。分別選取5個(gè)視野，并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡小體形成率(凋亡小體細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)×100%)，取5次結(jié)果的平均值來評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡率。

1.6 Caspase-3活性的測(cè)定按Caspase-3 Colorimeric Assay Kit說明書進(jìn)行。1×106細(xì)胞溶于50μL細(xì)胞溶解液后，加入2×反應(yīng)緩沖液50μL和酶底物(DEVD-pNA)5μL，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)值。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定采用DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。接種于96孔板，經(jīng)藥物處理后的各組EPCs，用10μmol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗3次以去除探針，酶標(biāo)儀檢測(cè)DCF，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。DCF相對(duì)熒光強(qiáng)度(%)=處理組的熒光值/對(duì)照組的熒光值×100%。

1.8 細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)定采用JC-1法。接種于96孔板，經(jīng)藥物處理后的各組EPCs，除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，滴加100μL JC-1工作液，37℃、50 m L/L CO2孵箱中培養(yǎng)20 min，1×Incubation Buffer洗2遍，于熒光顯微鏡下觀察。JC-1是一種陽離子脂質(zhì)熒光染料，作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，低濃度時(shí)以單體形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，JC-1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常細(xì)胞線粒體的膜電位(ΔΨ)具有極性，JC-1依賴于ΔΨ的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；而在線粒體膜通透性改變，線粒體膜電位去極化時(shí)，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根據(jù)這一特征檢測(cè)線粒體膜電位的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析(One way ANOVA)和LSD進(jìn)行多樣本間均值比較，采用Levene進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

高校第二課堂是第一課堂的補(bǔ)充，它不受時(shí)間和空間的限制，具備多種形式,成為素質(zhì)發(fā)展、創(chuàng)新意識(shí)培養(yǎng)和實(shí)踐能力提升的重要載體，正是由于第二課堂教學(xué)的靈活性和新穎性,使其越來越受到高校的重視。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的形態(tài)與鑒定EPCs體外培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)集落，4 d后多數(shù)集落已經(jīng)形成，于第7天后加入DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I染色，其中90%細(xì)胞吞噬DiI-Ac-LDL(熒光顯微鏡下呈紅色)，F(xiàn)ITC-UEA-I (熒光顯微鏡下呈綠色)染色陽性(圖1)。采用PE標(biāo)記的鼠抗人CD133、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD34以及PE標(biāo)記的鼠抗人VEGF-R2抗體于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，結(jié)果顯示，CD133、CD34及VEGF-R2陽性率分別為(89.5±5.3)%、(66.3±6.3)%和(93.1± 8.3)%，證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。

圖1 EPCs的熒光染色鑒定Fig.1 Fluorescent staining of EPCs

2.2 tBHP損傷EPCs模型的建立MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度t BHP作用EPCs 6 h后，細(xì)胞存活率表現(xiàn)為隨藥物濃度增加而降低的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)tBHP濃度在30μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為(83.61± 10.12)%，60μmol/L時(shí)為(65.11±8.86)%，120 μmol/L時(shí)為(34.72±13.22)%，至最大濃度240 μmol/L時(shí)，細(xì)胞大部分死亡，細(xì)胞存活率為(6.34± 4.66)%，其與對(duì)照組(100%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)tBHP濃度為100μmol/L左右時(shí)，細(xì)胞存活率約維持在50%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇該條件建立tBHP誘導(dǎo)EPCs的氧化損傷模型。

2.3 ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率下降的影響MTT結(jié)果顯示，預(yù)實(shí)驗(yàn)中給予濃度0.1、1、10 nmol/L的ASX對(duì)EPCs的存活率沒有影響。與損傷模型組相比較，各實(shí)驗(yàn)濃度的ASX呈劑量依賴性提高細(xì)胞存活率，當(dāng)ASX的濃度達(dá)到10 nmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率從47.6%升高至85.3%，顯著提高EPCs存活率(P＜0.05，圖2)。

2.4 ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)EPCs凋亡的影響應(yīng)用DAPI染細(xì)胞檢測(cè)ASX對(duì)tBHP引起EPCs凋亡的影響。tBHP 100μmol/L處理EPCs 6 h后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡核形態(tài)學(xué)改變。與對(duì)照組相比，細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，核固縮明顯，凋亡小體數(shù)目顯著增加，ASX預(yù)處理24 h后，可顯著改善細(xì)胞凋亡狀況，隨著作用濃度的增加，作用逐步增強(qiáng)，在10 nmol/L ASX濃度時(shí)，改善最為顯著。經(jīng)過凋亡小體計(jì)算統(tǒng)計(jì)，正常對(duì)照組凋亡小體形成率為(4.8±0.7)%，100μmol/L t BHP損傷6 h組凋亡小體形成率(27.8±3.2)%，與正常對(duì)照組相比明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，n=6)，ASX在0.1、1、10 nmol/L預(yù)處理24 h后再加100μmol/L tBHP處理6 h，凋亡小體形成率分別為(20.4±2.9)%，(14.9±1.7)%和(7.8±0. 7)%(P＜0.05，n=6)，可見，ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用(圖3)。

圖2 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率的檢測(cè)及觀察Fig.2 EPCs viability test(，n=6)

圖3 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的檢測(cè)Fig.3 EPCs apoptosis test(，n=6)

2.5 ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)EPCs caspase-3活性的影響應(yīng)用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，t BHP誘導(dǎo)EPCs Caspase-3活性顯著升高(P＜0.05)；而經(jīng)ASX預(yù)處理24 h后，Caspase-3活性出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，隨著劑量加大而下降(P＜0.05)，提示ASX可通過調(diào)節(jié)Caspase-3活性抑制tBHP誘導(dǎo)的EPCs細(xì)胞凋亡(表1)。

2.6 ASX對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響tBHP滲透進(jìn)入細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)化為叔丁氧基，并進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的形成。DCHF-DA是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的分子探針，其本身無熒光，當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生一種熒光物質(zhì)DCF，DCF的熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μmol/L t BHP損傷組，EPC細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加；而經(jīng)ASX(0.1、1、10 nmol/L)預(yù)處理組，EPCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性降低，在10 nmol/L ASX濃度時(shí)，降低ROS水平最為顯著，熒光強(qiáng)度較損傷模型組明顯減弱(圖4)。

表1 ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)EPCs Caspase-3活性的影響Tab.1 Effect of ASX on Caspase-3 activity of EPCs injured by tBHP(n=6，)

表1 ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)EPCs Caspase-3活性的影響Tab.1 Effect of ASX on Caspase-3 activity of EPCs injured by tBHP(n=6，)

與對(duì)照組比較，△P＜0.05，與tBHP損傷模型組比較，*P＜0.05。

組別Caspase-3活性(A405nm) 0.096±0.014 tBHP 0.345±0.018△0.1 nmol/L ASX+tBHP 0.291±0.013*1 nmol/L ASX+tBHP 0.209±0.004*10 nmol/L ASX+tBHP 0.169±0.013對(duì)照組*

2.7 EPCs線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，正常對(duì)照組(Control)為黃綠色，100μmol/L tBHP處理6 h(tBHP+/ASX-)，線粒體膜電位丟失，綠色熒光強(qiáng)度變強(qiáng)，而經(jīng)10 nmol/L ASX預(yù)處理24 h后(tBHP+/ASX+)，其線粒體膜電位丟失得以明顯抑制，呈現(xiàn)黃綠素?zé)晒?，但較對(duì)照組黃綠色稍偏綠。說明ASX能抑制tBHP引起的EPCs線粒體膜電位去極化，從而提高線粒體膜電位水平，進(jìn)而對(duì)線粒體膜電位丟失促發(fā)的EPCs凋亡具有一定的保護(hù)作用(圖5)。

圖4 ASX對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effects of ASX on intracellular ROS(，n=6)

圖5 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)Fig.5 Mitochondrial membrane potential of EPCs in each group

3 討 論

ASX分子式：C4OH52O4，相對(duì)分子量596.86，是一種酮式類胡蘿卜素，源自雨生紅球藻類受到較長(zhǎng)時(shí)間環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種抵御不良環(huán)境，具有多種生物活性的物質(zhì)，其極高的抗氧化活性，可應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激造成的損傷，使細(xì)胞渡過難關(guān)［10］。tBHP是用于構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷的常用試劑，其化學(xué)性質(zhì)與過氧化氫(H2O2)相似，但更穩(wěn)定，不易降解。tBHP能模擬氧化應(yīng)激損傷，直接破壞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞或線粒體膜的破壞［11］。

細(xì)胞凋亡是多基因、多種分子參與的復(fù)雜生命過程。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生和調(diào)控機(jī)制中的重要分子，是凋亡途徑下游進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase-3的激活是凋亡發(fā)生的最早期事件，它對(duì)染色質(zhì)固縮、DNA片段化起重要的執(zhí)行作用［12］。本研究通過DAPI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tBHP可明顯的引起內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡，單純ASX對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞無損傷作用，ASX對(duì)tBHP誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用。在ASX抑制EPCs的凋亡中發(fā)現(xiàn)ASX對(duì)Caspase-3的活性有下調(diào)效應(yīng)，在10 nmol/L水平能顯著抑制其激活。

線粒體是最重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控靶點(diǎn)，同時(shí)，線粒體還是ROS的主要來源，并易受氧化應(yīng)激損傷。研究表明，胞質(zhì)內(nèi)ROS可作為信號(hào)誘導(dǎo)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放、Ca2+內(nèi)流和線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)，同時(shí)促進(jìn)自身線粒體及其他線粒體產(chǎn)生ROS，ROS升高又進(jìn)一步誘導(dǎo)MPTP開放，兩者互為因果，形成惡性循環(huán)［13］。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降是MPTP開放的表征，MMP下降，氧化磷酸化解偶聯(lián)，線粒體基質(zhì)腫脹，外膜破裂，導(dǎo)致各種凋亡因子包括最重要的細(xì)胞色素C釋放于胞質(zhì)中，啟動(dòng)細(xì)胞線粒體途徑凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tBHP損傷組細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，線粒體膜電位明顯低于空白對(duì)照組，而ASX保護(hù)組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，線粒體膜電位較損傷組有明顯的提高?？梢?，tBHP增加細(xì)胞內(nèi)ROS，降低EPCs線粒體膜電位，啟動(dòng)了線粒體途徑細(xì)胞凋亡，而ASX能明顯減少ROS生成，提高EPCs線粒體膜電位，抑制tBHP誘導(dǎo)的線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，ASX通過提高線粒體膜電位，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成造成的線粒體氧化應(yīng)激損傷，可能進(jìn)而下調(diào)Caspase-3活性，最終起到抗EPCs凋亡的功能。本研究為ASX抗氧化應(yīng)激損傷，改善EPCs數(shù)量和功能，促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］WERNER N，KOSIOL S，SCHIEGL T，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes［J］.N Engl J Med，2005，353(10)：999-1007.

［2］INGRAM DA，KRIER TR，MEAD LE，et al.Clonogenic endothelial progenitor cells are sensitive to oxidative stress［J］.Stem Cells，2007，25(2)：297-304.

［3］TURGEON J，DUSSAULT S，HADDAD P，et al.Probucol and antioxidant vitamins rescue ischemia-induced neovascularization in mice exposed to cigarette smoke：Potential role of endothelial progenitor cells［J］.Atherosclerosis，2010，208(2)：342-349.

［4］IMANISHI T，TSUJIOKA H，AKASAKA T.Endothelial progenitor cells dysfunction and senescence：contribution to oxidative stress［J］.Curr Cardiol Rev，2008，4(4)：275-286.

［5］KIM JH，CHOI W，LEE JH，et al.Astaxanthin inhibits H2O2-mediated apoptotic cell death in mouse neural progenitor cells via modulation of P38 and MEK signaling pathways［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，19(11)：1355-1363.

［6］ADLURI RS，THIRUNAVUKKARASU M，ZHAN L.et al. Cardioprotective efficacy of a novel antioxidant mix vitae proagainst ex vivo myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Cell Biochem Biophys，2013，67(2)：281-286.

［7］MANABE E，HANDA O，NAITO Y，et al.Astaxanthin protects mesangial cells from hyperglycemia-induced oxidative signaling［J］.J Cell Biochem，2008，103(6)：1925-1937.

［8］DONG LY，JIN J，LU G，et al.Astaxanthin attenuates the apoptosis of retinal ganglion cells in db/db mice by inhibition of oxidative stress［J］.Mar Drugs，2013，11(3)：960-974.

［9］DERNBACH E，URBICH C，BRANDES RP，et al.Antioxidativstress-associated genes in circulating progenitor cells：evidence for enhanced resistance against oxidative stress［J］. Blood，2004，104(12)：3591-3597.

［10］PASHKOW F，WATUMULL D，CAMPBELL C.Astaxanthin：a novel potential treatment for oxidative stress and inflammation in cardiovascular disease［J］.Am J Cardiol，2008，101(10A)：58-68.

［11］HAIDARAK，MOREL I，ABALEA V.Mechanism of tertbutylhydroperoxide induced apoptosis in rat hepatocytes：involvement of mitochondria and endoplasmic reticulum［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1542(1-3)：173-85.

［12］CASE J，INGRAM DA，HANELINE LS，et al.Oxidative stress impairs endothelial progenitor cell function［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(11)：1895-1907.

［13］DAI DF，CHEN T，SZETO H，et al.Mitochondrial targeted antioxidant peptide ameliorates hypertensive cardiomyopathy［J］.J Am Coll Cardiol，2011，58(1)：73-82.

(編輯 卓選鵬)

Astaxanthin attenuates endothelial progenitor cell apoptosis induced by oxidative stress via mitochondria-targeted protective mechanism

GONG Zhi-gang1，2，Zhang Zai-wei3，JIANG Qi-jun2，DING Shi-fang2
(1.Graduate School，Southern Medical University，Guangzhou 510515；2.Department of Cardiology，Wuhan General Hospital of Guangzhou Command，Wuhan 430070；3.Department of Cardiovascular Medicine，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the effects of astaxanthin on oxidative stress-induced apoptosis of endothelial progenitor cells(EPCs)in vitro and to explore its underlying mechanisms.MethodsEPCs cultured in vitro were divided into normal control group，model group(100μmol/L tBHP)，and astaxanthin plus tBHP(pretreated with 0.1，1，10 nmol/L astaxanthin for 24 h and then cultured with 100μmol/L tBHP for 6 h).The cell viability was measured by MTT method；the level of reactive oxygen species(ROS)was determined by DCFH-DA method；the changes of mitochondrial membrane potential(MMP)and apoptosis ratio were detected by JC-1 method and DAPI method，respectively.Caspase 3 was assayed by colorimetry.ResultsCompared with normal control group，100μmol/L tBHP obviously caused the apoptosis of EPCs(P＜0.05)，while astaxanthin could reduce this damage，which was presented by the significantly decreased cell apoptosis ratio(P＜0.05)，increased MMP and downregulated Caspase-3 expression.ConclusionAstaxanthin inhibits oxidative stress-induced apoptosis of EPCs，and its mechanisms may be related to protecting the mitochondrial function.

oxidative stress；endothelial progenitor cell；astaxanthin；cell apoptosis；mitochondrial membrane potential

R285

A

1671-8259(2014)05-0599-06

10.7652/jdyxb201405007

2014-01-05

2014-03-20

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2012FFB06803) Supported by the Natural Science Foundation of Hubei Province(No.2012FFB06803)

丁世芳，主任醫(yī)師，教授.研究方向：心血管內(nèi)科臨床與基礎(chǔ)研究.E-mail：dingshifangmd@yahoo.com.cn

龔志剛(1971-)，男(漢族)，副主任醫(yī)師，博士研究生.研究方向：心血管內(nèi)科臨床研究.E-mail：13397199595@189.cn；張?jiān)賯?1970-)，男(漢族)，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師.研究方向：心血管內(nèi)科疾病.E-mail：zhzw2001@stu.xjtu.edu.cn，共同第一作者.

時(shí)間：2014-05-16 16∶03 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140524.2118.004.html