殷蘇綠，楊燕男，徐宏博，徐獻(xiàn)民，張志勇，常 娥，何 丹，徐建榮

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；3.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001）

魚(yú)類細(xì)胞體外離體培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代[1]，Wolf等1962年首次建立廣溫性魚(yú)類細(xì)胞系[2]，我國(guó)在上世紀(jì)80年代始先后建立了淡水魚(yú)如南方鯰[3]、草魚(yú)[4]、淡水白鯧[5]、鯉[6]和鯽[7]等的細(xì)胞系，魚(yú)類細(xì)胞系的建立為魚(yú)類病毒生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究提供了理想的體外研究體系.

四鰓鱸（Trachidermus fasciatus），別名松江鱸、媳婦魚(yú)、花鼓魚(yú)等，是東亞暖溫帶沿海的降河性洄游魚(yú)類，在我國(guó)渤海、黃海及東海沿岸均有分布，性成熟親魚(yú)在海水中繁殖、幼魚(yú)洄游至淡水水域生長(zhǎng)育肥，當(dāng)年繁殖的幼魚(yú)年底可達(dá)到性成熟，親魚(yú)繁殖后大部分死亡.四鰓鱸個(gè)體雖小，但肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為中國(guó)“四大淡水名魚(yú)”之一，曾作為我國(guó)國(guó)宴上的美味佳肴招待外國(guó)政要.

四鰓鱸對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件要求較高，尤其對(duì)溶解氧及水質(zhì)要求高，近年來(lái)，由于環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等因素，嚴(yán)重影響了四鰓鱸的洄游，導(dǎo)致四鰓鱸在中國(guó)的分布區(qū)急劇縮小，且現(xiàn)有種群的數(shù)量亦有逐年下降的趨勢(shì).目前我國(guó)國(guó)內(nèi)只有遼寧、河北、山東等地少數(shù)區(qū)域有野生四鰓鱸分布，其中只有遼寧省丹東市境內(nèi)的四鰓鱸尚有一定數(shù)量的種群分布，其他水域數(shù)量較少，長(zhǎng)江流域幾乎絕跡[8-10].四鰓鱸的天然資源已經(jīng)進(jìn)入了瀕危狀態(tài)，1988年四鰓鱸已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)對(duì)象，同年被列為“魚(yú)類優(yōu)先保護(hù)種名錄”一級(jí)十個(gè)物種之一[11]，因此有必要對(duì)四鰓鱸進(jìn)行更深入的研究，確實(shí)保護(hù)四鰓鱸種質(zhì)資源.魚(yú)類細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行魚(yú)類研究和種質(zhì)資源保護(hù)的有效途徑，目前對(duì)四鰓鱸細(xì)胞培養(yǎng)研究較少，王丹生對(duì)四鰓鱸鰭細(xì)胞進(jìn)行了體外培養(yǎng)的試驗(yàn)[12]，對(duì)四鰓鱸鰭條體外培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步探索，但對(duì)四鰓鱸內(nèi)臟組織體外培養(yǎng)未見(jiàn)報(bào)道.本研究以四鰓鱸內(nèi)臟組織為材料進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，探索保護(hù)四鰓鱸種質(zhì)資源和進(jìn)行四鰓鱸研究的有效方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料來(lái)源

實(shí)驗(yàn)材料為人工養(yǎng)殖的四鰓鱸幼魚(yú)，幼魚(yú)體長(zhǎng)為5～7 cm，體重2～3 g，由常熟理工學(xué)院長(zhǎng)江特色水生生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 材料處理

實(shí)驗(yàn)前用含青鏈霉素抗生素（0.28%）的無(wú)菌水暫養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用魚(yú)24 h，備用.

1.2 試劑

青鏈霉素抗生素（hyclone）、鼠尾膠原（sigma）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（GIBCO）、澳洲胎牛血清（GIBCO）、培養(yǎng)基DMEM（GIBCO）、M199（GIBCO）、0.25%胰酶（GIBCO）、PBS（pH=7.4）由蘇州輝博生物公司提供.

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 組織取材

先將魚(yú)置于0.1%KMnO4中浸泡30 min，用無(wú)菌棉簽擦凈實(shí)驗(yàn)用魚(yú)表面的粘液，解剖魚(yú)體，取魚(yú)體的腎臟、肝臟、心臟、脾臟，用添加青鏈霉素抗生素（0.28%）的PBS沖洗3次，然后轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中漂洗3次，備用.

1.3.2 原代培養(yǎng)

采用組織塊培養(yǎng)法：將已處理的四鰓鱸內(nèi)臟組織轉(zhuǎn)入到添加培養(yǎng)基（10%FBS）的培養(yǎng)皿中，剪成1 mm3小塊，培養(yǎng)前將1 mm3的組織塊取出并均勻地接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底壁，接種培養(yǎng)瓶分別置于5%的CO2培養(yǎng)箱和無(wú)CO2培養(yǎng)箱.27℃恒溫培養(yǎng)6 h后，添加5 mL培養(yǎng)基（10%FBS），輕輕翻瓶，使組織塊浸沒(méi)于培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d更換培養(yǎng)基一次.

1.3.3 不同培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）

實(shí)驗(yàn)材料為四鰓鱸內(nèi)臟組織，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，每3 d更換培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)周期為9 d.

1.4 培養(yǎng)細(xì)胞的活體觀察

在倒置顯微鏡下對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行活體觀察、攝影記錄其生長(zhǎng)狀況及形態(tài)特征.

表1 不同培養(yǎng)基條件

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)

在27℃培養(yǎng)條件下，四鰓鱸內(nèi)臟組織（以肝細(xì)胞為例）接種后3～5 h均有細(xì)胞遷出，并向外周遷移和伸展，外緣細(xì)胞貼壁（圖1）.遷出的細(xì)胞大都呈圓形，胞漿透明，培養(yǎng)初期（10～18 h）生長(zhǎng)暈內(nèi)側(cè)極其透明，細(xì)胞之間的界限難以觀察清楚.而在生長(zhǎng)暈外側(cè)，由于細(xì)胞遷移迅速，彼此間距增大，細(xì)胞界限漸變?yōu)榍逦?，生長(zhǎng)暈邊緣不甚整齊，2～3 d后隨著細(xì)胞的增殖，生長(zhǎng)暈邊緣逐漸圓滑（圖2）.4～5 d后內(nèi)臟細(xì)胞遷移形成的生長(zhǎng)暈擴(kuò)展迅速.6 d后，生長(zhǎng)細(xì)胞匯合，鑲嵌狀排列，并有接觸抑制現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)集落占瓶底2/3（見(jiàn)圖3）.在原代培養(yǎng)中，觀察到生長(zhǎng)暈均由圓形細(xì)胞組成.

圖1 3～5 h細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)

圖2 2～3 d細(xì)胞生長(zhǎng)暈

圖3 6 d細(xì)胞生長(zhǎng)集落匯合

圖4 DMEM下a培養(yǎng)基條件

2.2 不同培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)

以肝細(xì)胞為例，在DMEM下a培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)良好（圖4），b培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)較弱（圖5），c培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)中等（圖6、表2）.

在M199下a培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)良好（圖7），b培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)較弱（圖8），c培養(yǎng)基條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)中等（圖9、表3）.

比較可得，采用M199，添加青鏈霉素抗生素（0.28%）及10%小牛血清和1%堿性成纖維生長(zhǎng)因子，pH值調(diào)整為7.2～7.4的培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的內(nèi)臟組織細(xì)胞繁殖最快.

表2 在DMEM培養(yǎng)基不同培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

2.3 不同內(nèi)臟組織細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

將四鰓鱸的肝臟、腎臟、脾臟、心臟分別取出來(lái)，置于相同的培養(yǎng)條件 下 [M199（10%FBS、雙抗、生長(zhǎng)因子）]進(jìn)行培養(yǎng)，一個(gè)周期后，肝臟組織遷出的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈圓形排列緊密（圖10），心臟組織遷出的細(xì)胞生長(zhǎng)較旺盛，呈纖維狀向外圍擴(kuò)散（圖11），腎臟組織遷出的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈不規(guī)則狀，繞組織塊周圍零散分布（圖12），脾臟組織遷出的細(xì)胞生長(zhǎng)較弱，有細(xì)胞遷出，但生長(zhǎng)暈較?。▓D13、表4）.

圖5 DMEM下b培養(yǎng)基條件

圖6 DMEM下c培養(yǎng)基條件

表3 在M199培養(yǎng)基不同培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

表4 相同條件下不同組織細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)材料選擇與處理

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)不宜過(guò)大（老），應(yīng)選處于生長(zhǎng)期的幼魚(yú)，幼魚(yú)機(jī)體生長(zhǎng)代謝旺盛、細(xì)胞分裂速度快，細(xì)胞培養(yǎng)容易獲得成功.實(shí)驗(yàn)用魚(yú)解剖之前先用雙抗水靜養(yǎng)一天后抽血，并放凈內(nèi)臟組織中的血液，以減少血細(xì)胞對(duì)組織培養(yǎng)的影響.

無(wú)菌處理是動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵，采用青鏈霉素抗生素對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行預(yù)處理既能達(dá)到殺菌的目的，又可以減少后續(xù)步驟的染菌機(jī)會(huì).青霉素是能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，而鏈霉素與結(jié)核桿菌菌體核糖核酸蛋白體蛋白質(zhì)結(jié)合，起到干擾結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)合成的作用，從而殺滅或抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng).同時(shí)在實(shí)驗(yàn)前用0.1%KMnO4浸泡30 min也是為了在不影響實(shí)驗(yàn)魚(yú)活力的情況下對(duì)魚(yú)進(jìn)行活體消毒殺菌，防止培養(yǎng)用材料被細(xì)菌感染.本試驗(yàn)表明：用5～7 cm長(zhǎng)幼魚(yú)，經(jīng)消毒殺菌處理和無(wú)菌操作，在M199培養(yǎng)基中添加青鏈霉素抗生素（0.28%）及10%小牛血清和1%堿性成纖維生長(zhǎng)因子，控制培養(yǎng)溫度為27℃、pH值為7.2～7.4，CO2濃度為 5%的 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的內(nèi)臟組織細(xì)胞繁殖最快.

圖7 M199下a培養(yǎng)基條件

圖8 M199下b培養(yǎng)基條件

圖9 M199下c培養(yǎng)基條件

圖10 肝臟組織遷出的細(xì)胞

3.2 離體細(xì)胞原代生長(zhǎng)特征

進(jìn)行魚(yú)類組織培養(yǎng)時(shí)，大多采用哺乳動(dòng)物的方法[2,13].經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用組織塊法能成功培養(yǎng)四鰓鱸的內(nèi)臟組織細(xì)胞，表明此法對(duì)四鰓鱸這四種內(nèi)臟細(xì)胞培養(yǎng)是適用的.在此培養(yǎng)條件下，組織塊法更易獲得原代培養(yǎng)細(xì)胞，由于組織塊的存在，使培養(yǎng)環(huán)境與整體動(dòng)物的生理環(huán)境更相近，從而有利于離體細(xì)胞的生存和增殖[14].

四鰓鱸心臟、肝臟、脾臟、腎臟4種組織在27℃、M199（10%FBS）條件下均表現(xiàn)出了不同程度的生長(zhǎng).肝臟、心臟細(xì)胞遷出時(shí)間分別為3～5 h、10～12 h，形成生長(zhǎng)暈的時(shí)間分別為5 d和6 d，生長(zhǎng)暈直徑都可達(dá)5 mm左右.生長(zhǎng)因子在實(shí)驗(yàn)中起到了重要的作用，避免了心臟和腎臟細(xì)胞遷出需要經(jīng)過(guò)的潛伏期[15].

3.3 離體細(xì)胞形態(tài)特征

心臟組織在培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞呈纖維樣，立體感強(qiáng)、透明.肝臟組織在培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)極為相似，種類單一，均為圓形樣，細(xì)胞排列緊密、整齊.脾臟組織在培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞多圓球形，少數(shù)呈分叉的多枝形和針形.

腎臟細(xì)胞與上述三種細(xì)胞的組成不同，心、肝、脾這三種組織的細(xì)胞在培養(yǎng)周期中幾乎只有一種細(xì)胞類型，而腎臟組織遷出的細(xì)胞出現(xiàn)了兩種細(xì)胞類型：一種是呈緊密排列狀的小型透明細(xì)胞，另一種略大，排列疏松.從同一塊組織上長(zhǎng)出不同的細(xì)胞生長(zhǎng)暈的現(xiàn)象意味著這些細(xì)胞可能是來(lái)自同一組織的不同組成部分[16].

圖11 心臟組織遷出的細(xì)胞

圖12 腎臟組織遷出的細(xì)胞

圖13 脾臟組織遷出的細(xì)胞

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