郁建鋒，顧志良，邵 芳，馮曉夏

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin，MSTN）屬于TGF-β（transforming growth factor β，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）超家族中的一個(gè)成員，最早在小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中被克隆的基因.利用基因敲除技術(shù)研究它的功能發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除的鼠是正常野生型小鼠大小的2～3倍，其肌肉細(xì)胞增生、肥大，整個(gè)身體的骨骼肌量明顯增加，表明MSTN在調(diào)控骨骼肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育中起著十分重要的作用[1-2].

魚(yú)類MSTN的研究也越來(lái)越多，斑馬魚(yú)、虹鱒、大西洋鮭、金頭鯛、羅非魚(yú)[3]、鯉和鳡等魚(yú)類中均克隆到MSTN基因.魚(yú)類MSTN除在骨骼肌表達(dá)以外，還可在魚(yú)類的其他多個(gè)組織如肝、心、胃、鰓、卵巢、精巢、腎、肌肉、眼和腦等中表達(dá)，與哺乳類的表達(dá)存在差異性.在抑制MSTN的功能抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)得到了提高，甚至引起肌肉增生或肥大[4].說(shuō)明MSTN在魚(yú)肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育也有著重要的作用，因此研究MSTN基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)有重要意義.

鳡屬鯉形目，鯉科，雅羅魚(yú)亞科，鳡屬，為江河、湖泊中大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一.我們?cè)鴮?duì)鳡MSTN基因的研究發(fā)現(xiàn)，其在肌肉和腦中表達(dá)量最高，在心肌中也有較高表達(dá)，在肝臟、腸、鰓和腎等組織的表達(dá)不明顯，表明鳡MSTN基因除對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)控作用以外，可能還存在其他生理功能[5]，因此需對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和調(diào)控作進(jìn)一步的深入探討，解析鳡MSTN的作用模式，克隆了該基因的兩個(gè)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)，為其結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)的研究打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及總DNA提取

鳡由江蘇省蘇州市長(zhǎng)江特色水產(chǎn)工程中心提供，取其肌肉，采用酚、氯仿法提取基因組DNA，保存于-80℃冰箱.

1.2 鳡MSTN內(nèi)含子的擴(kuò)增

通過(guò)鳡MSTN的cDNA序列和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）MSTN的基因序列（GU014395.1）的比對(duì)，分別在鳡MSTN 兩個(gè)內(nèi)含子上 下游的外顯子上 設(shè)計(jì)引 物 gynhza5：5′-AACATGCCACCACAGAGACC-3′，gynhza3：5′-GGTTCGCTTGGATTTTCGGAC-3′；gynhb5：5′-CGTCTTGGCAGAGTATAGAC-3′，gynhzb3：5′-GGCCCTCT?GAGATTTTCACC-3′.用此兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鳡MSTN基因的內(nèi)含子1和2，反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL （2.5 mmol/L each），10 μmol/L 引 物 gynhza5/3 和 gynhzb5/3 各1μL，rTaq（5 U/μL）0.2 μL，1 μL基因組DNA，ddH2O 17.3 μL；PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃×35 sec，58℃×35 sec，72℃×1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，膠回收目的片段，并克隆入pMD19-T后測(cè)序（上海桑尼生物公司測(cè)序）.

1.3 染色體步移法擴(kuò)增鳡MSTN基因的啟動(dòng)子

根據(jù)已獲得的鳡MSTN基因序列設(shè)計(jì)三個(gè)特異性引物gympy1：5′-GAGCCTGTTTGAGTCG?GAGTTTG-3′，gympy2：5′-TGGTCATGATGGTCTCTGTGGTG-3′，gympy3：5′-GTGCGCCGTTATATCTCCAT?TACC-3′.然后與Genome Walking Kit（TaKaRa）提供的4條兼并引物對(duì)鳡基因組進(jìn)行染色體步移擴(kuò)增MSTN 5′末端未知片段，按照試劑盒程序進(jìn)行，分別以3條特異性引物與4條兼并引物對(duì)鳡基因組進(jìn)行4個(gè)平行的3次巢式PCR，將第三次獲得的特異性條帶克隆入pMD19-T后測(cè)序鑒定（上海桑尼生物公司測(cè)序）.

1.4 序列分析

應(yīng)用BLAST工具將獲得的鳡MSTN基因的內(nèi)含子在線進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)合DNAMAN5.0軟件進(jìn)行物種間的同源性比對(duì).同時(shí)采用在線啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析軟件TRANSFAC AliBata2.1（http：//www.gene-regulation.com/pub/programs.html#alibaba2）[6]對(duì)所獲得的鳡MSTN啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，獲得鳡MSTN啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).

2 結(jié)果

2.1 鳡MSTN內(nèi)含子序列的擴(kuò)增結(jié)果

以兩對(duì)引物gynhza5/3和gynhzb5/3對(duì)鳡基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在900 bp和1200 bp位置擴(kuò)增到兩條特異性條帶（見(jiàn)圖1），與預(yù)期所要擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度基本一致，對(duì)片段回收克隆測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)確認(rèn)為這兩個(gè)片段內(nèi)包含了鳡MSTN的兩個(gè)內(nèi)含子序列.

2.2 鳡MSTN內(nèi)含子序列分析

圖1 鳡MSTN基因內(nèi)含子序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果(M：DL-2000 DNA marker)

與鳡MSTN cDNA的序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子1全長(zhǎng)為789 bp，A/T和G/C的堿基組成分別為66.7%與33.3%；內(nèi)含子2全長(zhǎng)為987 bp，A/T和G/C的堿基組成分別為65.0%與35.0%.將鳡MSTN基因內(nèi)含子1、2以DNAMAN5.0軟件分別與其他參照物種的MSTN基因內(nèi)含子1、2進(jìn)行比對(duì)分析（結(jié)果見(jiàn)表1）.鳡MSTN內(nèi)含子與鯉科魚(yú)類的同源性都相對(duì)較高，且鳡MSTN基因內(nèi)含子1與鯉魚(yú)MSTN1a的同源性最高（67.21%）；內(nèi)含子2與鯉魚(yú)MSTN的同源性最高（51.21%）.鳡與其他魚(yú)類、鳥(niǎo)類以及哺乳類的同源性都較低；且在比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)含子的兩端沒(méi)有廣泛的序列同源性（數(shù)據(jù)未列出）.對(duì)這25個(gè)物種的MSTN內(nèi)含子剪切位點(diǎn)保守性分析的結(jié)果顯示，兩個(gè)內(nèi)含子的兩側(cè)邊緣分別起始于二核苷酸GT，終止于二核苷酸AG（遵循內(nèi)含子剪接的GT-AG規(guī)則），且第4個(gè)核苷酸位點(diǎn)上的堿基都為A.統(tǒng)計(jì)得到內(nèi)含子1剪切位點(diǎn)邊緣序列為：G100T100A72A100G92T80……Py100NC72A100G100；內(nèi)含子2剪切位點(diǎn)的邊緣序列為：G100T100G76A100G100C52……Py96NC88A100G100.

表1 鳡MSTN基因內(nèi)含子的同源性比較

2.3 鳡MSTN啟動(dòng)子序列分析

利用染色體步移技術(shù)從鳡基因組中克隆了一段約662 bp 的序列，應(yīng)用Blast在線比對(duì)確認(rèn)該片段為MSTN啟動(dòng)子的部分序列，通過(guò)與藍(lán)黑鯪（Labeo calbasu）（HQ850574.1）、卡特拉魮（Catla catla）（HQ850575.1）、纓野鯪（Labeo fimbriatus）（HQ850576.1）的MSTN基因比對(duì)確定了鳡MSTN基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS），并結(jié)合TRANSFAC對(duì)此序列進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征分析預(yù)測(cè).結(jié)果顯示，鳡MSTN基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的-31～-26、-230～-225有兩個(gè)潛在TATA框（即TBP結(jié)合位點(diǎn)），在-75～-70和-437～-428存在2個(gè)可能CTF結(jié)合位點(diǎn)，在-192～ -182、-283～ -274、-313～ -303、-322～-313、-373～ -364、-418～ -410、-556～ -547和 - 573～-564存在8個(gè)潛在CCAAT框/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/%enhangcer bingding protein，C/EBPα）作用位點(diǎn)，在-126～-117有一個(gè)潛在的C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)，-25～-17有一個(gè)潛在C/EBPγ結(jié) 合 位 點(diǎn) ，在 -173～-159、-564～-555和-600～ -591有3個(gè)激活蛋白1（stimulato?ry protein 1，SP1）結(jié) 合位點(diǎn) ，-150～ -141和-287～-278存在2個(gè)激活蛋白（activator protein 1，AP1） 結(jié) 合 位 點(diǎn) ，在-202～-197、-280～-275和-451～-446存在3個(gè)E-box元件.在克隆得到的這個(gè)片段中還預(yù)測(cè)到了其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：4個(gè) Oct1、2個(gè) GATA、2個(gè) HNF1、1個(gè)HNF-3、1個(gè)NF-κB和1個(gè)CREB（見(jiàn)圖2）.

圖2 部分鳡MSTN基因啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

3 討論

通過(guò)在鳡MSTN基因的外顯子1、2和外顯子2、3設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物，成功克隆出了該基因的內(nèi)含子1、內(nèi)含子2的序列.鳡MSTN基因內(nèi)含子1、2分別與其他物種MSTN基因相應(yīng)內(nèi)含子序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種的內(nèi)含子長(zhǎng)短不一，差異顯著.核苷酸的同源性與鯉科魚(yú)類MSTN基因內(nèi)含子1、2的同源性都較高（分別為60.42%～67.21%、40.00%～51.21%），與其他物種的同源性較低，這與傳統(tǒng)分類法將鳡分為屬鯉科類的結(jié)果是相一致的.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)鳡、斑馬魚(yú)、鯉和露斯塔野鯪四種鯉科魚(yú)類的MSTN基因內(nèi)含子1、內(nèi)含子2序列在不同位點(diǎn)存在缺失差異性，其中斑馬魚(yú)MSTN基因內(nèi)含子2在912～1000 bp處存在大片段的缺失，露斯塔野鯪MSTN基因的內(nèi)含子1、2都存在多處片段不同程度的缺失，它們雖然同屬鯉科，但MSTN內(nèi)含子序列的差異還是比較明顯的，這應(yīng)該與內(nèi)含子在物種進(jìn)化過(guò)程中突變后所受到的選擇壓力相對(duì)較小有關(guān).這些結(jié)果表明，MSTN基因的內(nèi)含子的同源性分析在魚(yú)類的分類中可能具有一定的輔助參考意義.盡管MSTN基因內(nèi)含子在不同物種間的差異非常明顯，但是其被加工剪接的信號(hào)卻相對(duì)比較保守.在所分析的這25個(gè)物種中，MSTN基因內(nèi)含子1、2的剪切都起始于GT，終止于AG.統(tǒng)計(jì)得到MSTN基因內(nèi)含子 1、2的邊界序列為 G100T100A72A100G92T80……Py100NC72A100G100、G100T100G76A100G100C52……Py96NC88A100G100.這為MSTN的mRNA精確加工成熟提供了重要保證.同時(shí)分析還發(fā)現(xiàn)在鳡MSTN基因的2個(gè)內(nèi)含子中存在多個(gè)潛在TATA啟動(dòng)子框，這些序列可能在鳡MSTN基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有一定的存在意義，同樣有助于基因的轉(zhuǎn)錄起始[7-9].

利用染色體步移技術(shù)在從鳡基因組中克隆獲得了662 bp的MSTN基因轉(zhuǎn)錄上游序列，通過(guò)在線比對(duì)分析確認(rèn)此序列為鳡MSTN基因啟動(dòng)子的部分序列.利用在線Blast和TRANSFAC AliBata2.1軟件對(duì)該片段進(jìn)行啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)分析，確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn).鳡MSTN基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游-31～-26、-230～-225各存在1個(gè)潛在TATA框（即TBP結(jié)合位點(diǎn)），具有典型的TATA框，與-75～-70存在的CTF作用位點(diǎn)保證了該基因能被有效、正確地轉(zhuǎn)錄起始.這一啟動(dòng)子片段還存在了10個(gè)CCAAT box（8個(gè)C/EBPα作用位點(diǎn)、1個(gè)C/EBPβ和1個(gè)C/EBPγ），C/EBP作用涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、新陳代謝和機(jī)體免疫，其中C/EBPβ可以與CREB和NF-κB或其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反式激活作用[9].在所克隆的鳡MSTN基因的啟動(dòng)子的部分序列也預(yù)測(cè)到了CREB和NF-κB的作用位點(diǎn)，推測(cè)這幾個(gè)預(yù)測(cè)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在鳡MSTN基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可能有著重要作用.Oct1是PUO家族的一員，其作用于“ATTTG?CAT”序列位點(diǎn)，能與Sp1和TBP相互作用，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始[10-11].所以此研究中鳡MSTN啟動(dòng)子部分序列中所預(yù)測(cè)到的4個(gè)Oct1作用位點(diǎn)可能含有對(duì)其轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控起重要作用的1個(gè)或幾個(gè)Oct1位點(diǎn).在所克隆的鳡MSTN基因的上游調(diào)控序列中還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)E框元件，其是Myogenic regulatory factor（MFR）的結(jié)合基序，是肌肉特異性基因較為普遍存在的元件，這3個(gè)E框與所預(yù)測(cè)的如AP1、C/EBP、NF-κB、Oct1和Sp1等在鳡的肌肉生長(zhǎng)應(yīng)答中可能發(fā)揮著重要作用[12].

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究克隆了鳡MSTN基因的內(nèi)含子1、2和啟動(dòng)子的部分序列，這為進(jìn)一步分析鳡MSTN基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制、分子調(diào)控機(jī)理、鳡生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理等奠定基礎(chǔ)，并對(duì)鳡的繁殖和育種工作有著重要的指導(dǎo)意義.

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