陳征兵，莫永正，張曉明，陳瑞愛，2，羅滿林，2＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東云浮527300）

美國Lehrer實(shí)驗(yàn)室1980年從兔肺巨噬細(xì)胞中分離得到了一種陽離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽，隨后科研人員從兔和人中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中發(fā)現(xiàn)了一系列一級結(jié)構(gòu)相似的小分子肽，由于這些小分子肽廣譜的抗微生物活性而被命名為“防御素（defensins）”。

防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子活性肽，主要存在于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞，并根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)特性可以分為α、β和θ防御素［1］；哺乳動物防御素通過與病原體生物膜直接的相互作用不但可以殺滅病原菌［2］，而且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用［3-4］，這些內(nèi)源性短肽是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的天然抗生素，代表著抵御病原體感染的一種天然防御機(jī)制［5-6］。與植物或昆蟲防御素相比，哺乳動物防御素?fù)碛懈鼮閺V泛的抗菌譜［7］；已經(jīng)有關(guān)于從組織中分離的犬β防御素的報道。犬防御素屬于β防御素家族，抗菌范圍廣，其對革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（如大腸埃希菌）、白色念珠菌和一些支原體（如解脲支原體）均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但也有研究表明，當(dāng)鹽濃度高于140 mmol／L時，其抗菌活性逐漸減弱。本試驗(yàn)采用人工合成犬防御素-3基因，整合至畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，并通過瓊脂空穴擴(kuò)散法測定其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌DH 5ɑ、金黃色葡萄球菌和畢赤酵母菌株X33 均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、TaqDAN 聚合酶，F(xiàn)ermenntas公司產(chǎn)品；DNA Marker、pMD18-T Simple Vector、T4DNA Ligase，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨和酵母提取物，OXOID 公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉 雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨，Sigma公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，OMEGA 公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 基因合成 根據(jù)NCBI（基因登錄號：NM-001024641.1）發(fā)表的犬防御素-3氨基酸序列，參照趙翔［8］畢赤酵母偏好性密碼子設(shè)計基因，并添加終止密碼子TAA，送上海英濰捷基全基因合成。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)改造后的密碼子序列設(shè)計合成了4條引物，分別用于擴(kuò)增目的基因和重組表達(dá)載體質(zhì)粒檢測，并在上下游引物分別添加EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如表1所示。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增 以P1、P2為引物，合成的犬防御素-3基因?yàn)槟０?，用TaqDNA 聚合酶擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為，95 ℃5 min；95 ℃30s，60 ℃30s，72 ℃45s，35 個循環(huán)；終延伸10 min；PCR 產(chǎn)物預(yù)計大小252bp。

1.2.4 pMD18-T-cbd-3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 膠回收PCR 產(chǎn)物，連接pMD18-T Simple Vector，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp＋抗性瓊脂平板篩選重組子；搖菌，PCR鑒定，抽提質(zhì)粒，EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，并將陽性克隆送上海立菲生物公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 pPiczɑC-cbd-3重組質(zhì)粒構(gòu)建 將測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-cbd-3 與酵母表達(dá)載體PpiczɑC，用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，連接回收片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH 5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，Zeocin抗性瓊脂平板篩選陽性克隆，用AOXP1、AOXP2引物作PCR鑒定和EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定后，將陽性克隆送往上海立菲生物公司測序。

1.2.6 pPiczɑC-cbd-3轉(zhuǎn)化及鑒定 抽提測序正確的重組質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3，SacⅠ線性化重組質(zhì)粒，膠回收線性化質(zhì)粒，取20μL回收產(chǎn)物和80μL X33感受態(tài)細(xì)胞混勻，加入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)1 500V，25μF，200Ω，5ms；迅速加入1mL冰預(yù)冷1mol／L的山梨醇，28 ℃靜置1.5h，然后加入1mL YPD 振蕩培養(yǎng)1h；4 000r／min 離心5 min，棄上清，沉淀物涂YPDS（ZeocinTM）抗性瓊脂平板，28 ℃靜置培養(yǎng)3d～5d，挑取平板菌落，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.7 陽性轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá) 將PCR鑒定為陽性的克隆接種至BMGY 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值為2.0～6.0，離心培養(yǎng)物棄上清，沉淀用BMMY 稀釋至OD值為1.0后進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)72h，每間隔24h加入甲醇至終濃度為10mL／L，并取樣測定蛋白濃度。

1.2.8 表達(dá)蛋白Tricine-SDS-PAGE 檢測 取一定量的誘導(dǎo)表達(dá)物，12 000r／min離心5 min，取上清，按比例加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水浴煮沸5min，12 000 再次離心5 min，上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測。

1.2.9 表達(dá)蛋白活性檢測 取適量處于對數(shù)生長期的菌液加入一定量45 ℃的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基（經(jīng)高壓滅菌）中，待培養(yǎng)基凝固后打孔，分別加入蛋白表達(dá)產(chǎn)物、空載體表達(dá)產(chǎn)物、空酵母培養(yǎng)液、氨芐青霉素陽性對照，先置4 ℃冰箱培養(yǎng)2h，然后置于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

以人工合成的基因cbd-3 為模板，用引物P1、P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，20g／L瓊脂糖電泳凝膠檢測，得到了與預(yù)期大?。?52bp）一致的目的條帶（圖1）。

圖1 PCR 目的基因的擴(kuò)增Fig.1 PCR amplifications of target gene

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T cbd-3的雙酶切鑒定

抽提質(zhì)粒pMD18-T cbd-3，經(jīng)EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，得到2條片段，1條大小2 700bp左右，另一條250bp左右，結(jié)果與預(yù)期相同（圖2）。

圖2 pMD18-T simple-cbd-3的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pMD18-T simple-cbd-3

2.3 重組質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3的雙酶切鑒定

抽提質(zhì)粒pPiczɑC-cbd-3，經(jīng)EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定，得到2條片段，1條大小3 600bp左右，另1條250bp左右，結(jié)果與預(yù)期相同（圖3）。

2.4 酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

酵母重組質(zhì)?？寺∮媒湍富虺樘嵩噭┖谐樘峄颍琍CR鑒定，在預(yù)期位置獲得了目的條帶（圖4）。

圖3 pPiczɑC-cbd-3的雙酶切鑒定

圖4 重組酵母菌的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant yeast

2.5 表達(dá)蛋白的檢測

將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物離心濃縮后，與5×SDS 上樣緩沖液混勻，沸水浴變性處理后，Tricine-SDSPAGE檢測，在8.5ku處出現(xiàn)目的條帶（圖5）。

圖5 目的蛋白Tricine-SDS-PAGE的檢測Fig.5 Tricine-SDS-PAGE detection of the objective protein

2.6 抑菌活性檢測

瓊脂空穴擴(kuò)散法檢測表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性，結(jié)果顯示表達(dá)的犬防御素-3對革蘭陰性菌（大腸埃希菌DH5ɑ）和革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）均有一定的抑菌活性（圖6）。

圖6 犬防御素-3對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory action of the expressed cbd-3to Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 討論

犬β防御素（-1，-2，-3）雖然都屬于犬β防御素家族，但存在部位有一定差異；原位雜交實(shí)驗(yàn)證明cbd-1主要存在于曲細(xì)精管支持細(xì)胞，cbd-2主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞，cbd-3主要在支持細(xì)胞，這說明犬β防御素主要表達(dá)在犬睪丸組織［9］。當(dāng)犬遭遇病原體感染時，犬防御素就會在體內(nèi)高效表達(dá)以抑制泌尿生殖道的病原體。鑒于犬防御素的作用機(jī)制和抗菌活性，本研究選擇巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)cbd-3，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)具備了其他表達(dá)系統(tǒng)不具備的優(yōu)點(diǎn)［10］，既克服了大腸埃希菌表達(dá)雜蛋白多，表達(dá)蛋白多以包涵體形式存在外，也避免了昆蟲表達(dá)細(xì)胞操作復(fù)雜，投入和產(chǎn)出嚴(yán)重不成比例的缺點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不但能高效表達(dá)重組蛋白，而且能對表達(dá)蛋白加工修飾。因此本試驗(yàn)選擇利用甲醇能力強(qiáng)，生長快的X-33酵母表達(dá)菌株和分泌型表達(dá)載體，能夠?qū)⒈磉_(dá)產(chǎn)物直接分泌到酵母培養(yǎng)基中，這樣不但避免了表達(dá)產(chǎn)物在菌體內(nèi)的堆積和對細(xì)胞毒害，同時也由于縮短了破碎菌體對蛋白的損傷；但對于載體系列來說，試驗(yàn)設(shè)計的重點(diǎn)是要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確；由于本試驗(yàn)中表達(dá)目的蛋白分子量相對較小，為避免多余氨基酸序列對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，因此在合成基因的時候，在目的基因末端添加了終止密碼子序列。由于畢赤酵母沒有天然質(zhì)粒，犬防御素-3通過SacⅠ線性化后以同源重組的方式整合至酵母基因組染色體內(nèi)，這樣不但增加了基因重組幾率，而且重組表達(dá)框更加穩(wěn)定。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)過程中伴隨著液泡蛋白酶和分泌途徑蛋白酶的產(chǎn)生，培養(yǎng)過程中，由于細(xì)胞密度不斷增加以及部分細(xì)胞的裂解，蛋白酶從胞液釋放到培養(yǎng)基中，致使目的蛋白被降解。蛋白酶降解目的蛋白是酵母表達(dá)系統(tǒng)共有缺陷，培養(yǎng)過程中，外源蛋白和蛋白酶都會不斷地釋放到培養(yǎng)基中，蛋白分泌和降解就同時發(fā)生了，降解發(fā)生的結(jié)果不僅導(dǎo)致目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解產(chǎn)生的氨基酸片段又給目的蛋白的純化帶來了困難，尤其是像本研究中表達(dá)的短肽，常規(guī)的分離方法很難將目的蛋白和降解產(chǎn)物分離開來，導(dǎo)致產(chǎn)品回收率下降，產(chǎn)品純度進(jìn)一步降低，蛋白的比活性降低，因此，做畢赤酵母表達(dá)時有必要采取一定措施減少蛋白酶的降解作用和提高外源蛋白的穩(wěn)定性，主要方法有培養(yǎng)基中添加10g／L酪氨酸水解物，在不影響細(xì)胞正常生長的情況下調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 等。

本研究中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 電泳分析，在8.5ku左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致，同時瓊脂空穴擴(kuò)散法檢測出現(xiàn)了抑菌圈，說明cbd-3在畢赤酵母中成功表達(dá)；研究選擇大腸埃希菌DH 5α和金黃色葡萄球菌作為抑菌活性的指示菌，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物抑菌效果和一定量氨芐青霉素陽性對照比較效果較差；根據(jù)抑菌圈大小判斷，表達(dá)產(chǎn)物和已報道的天然犬防御素-3 成熟肽也有不小差距，這可能是因?yàn)槌墒祀脑诒磉_(dá)中被進(jìn)行了影響結(jié)構(gòu)與活性的無關(guān)修飾［11］，因此繼續(xù)篩選高表達(dá)菌株和提高其抗菌活性將是下一步的研究工作重點(diǎn)。

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