王玉柱，職瑞娜,2，蘭夢寧，楊 凱，李衛(wèi)華,2*，丁訓誠

（1.上海市計劃生育科學研究所 國家計劃生育藥具重點實驗室，上海 200032； 2.復旦大學 上海醫(yī)學院，上海200032； 3.英國馬爾文儀器有限公司，上海 200233)

尼非韋羅微乳熱敏原位凝膠相變性和體外釋藥行為

王玉柱1，職瑞娜1,2，蘭夢寧1，楊 凱3，李衛(wèi)華1,2*，丁訓誠1

（1.上海市計劃生育科學研究所 國家計劃生育藥具重點實驗室，上海 200032； 2.復旦大學 上海醫(yī)學院，上海200032； 3.英國馬爾文儀器有限公司，上海 200233)

目的以尼非韋羅（nifeviroc，NFVR）為模型藥物制備一種微乳-熱敏原位凝膠（microemulsion thermosensitive in situ gel，ME-TISG），并對該凝膠的制劑學性質進行考察。方法 用溫控（75℃）相圖方法制備尼非韋羅微乳（nifeviroc microemulsion，NFVR/ME），并將其載入泊洛沙姆407（Poloxamer 407，P407）形成的凝膠中，用動態(tài)激光散射粒度儀及透射電子顯微鏡測定其粒徑、ζ電位及形態(tài)，利用高級旋轉流變儀對凝膠流變學進行研究；采用無膜溶出模型研究在頻率100 r·min-1下，NFVR/ME的釋放與凝膠溶蝕之間的關系。結果不同濃度NFVR/ME的平均粒徑為36.30～38.25 nm，且呈圓整均一球體，ζ電位-7.15～-7.22 mV，相轉變溫度為29.5℃，膠凝溫度為34.5℃，NFVR/ME-TISG在低溫（＜25℃）時為牛頓流體，黏度很小；隨著溫度升高，黏彈性增大，在35～37℃表現(xiàn)出典型的假塑性流體特征，復數(shù)黏度隨著剪切速率的升高而逐漸減小，呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象。ME中NFVR的釋放率受控于凝膠的溶蝕速率，二者呈現(xiàn)良好的線性關系（R2=0.98），遵循零級動力學特征，這種由溶蝕控制藥物釋藥的方式可以避免突釋效應。結論 熱敏原位凝膠是一種具有應用前景的新型陰道釋藥系統(tǒng)。

藥劑學；尼非韋羅；微乳；熱敏原位凝膠；復數(shù)黏度；相轉變溫度；膠凝溫度；體外釋藥

尼非韋羅（nifeviroc, NFVR）是我國具有自主知識產權的抗艾滋病藥物[1]，藥理研究顯示IC50在1～30 nmol·L-1之間，體外抗HIV活性強[2]；2007年NFVR口服片劑獲得SFDA國家一類新藥證書及藥品注冊批文，并進入臨床研究，I期試驗表明，口服NFVR片劑在50～800 mg內安全性和可接受性良好，可考慮作為預防艾滋病性傳播的陰道外用殺微生物劑。將NFVR制成水包油O/W型微乳，可將NFVR包裹于類脂核，形成粒徑30～50 nm、熱力學穩(wěn)定的微乳體系[3]。考慮到陰道內給藥效果還受到藥物滲漏和藥物滯留時間等的影響，將尼非韋羅微乳（nifeviroc microemulsion, NFVR/ME）與溫度敏感型凝膠材料結合應用，可以增溶不同脂溶性的藥物來提高它們的生物利用度[4]。其中，泊洛沙姆407（Poloxamer407，P407）是較為常用的一類新型陰道緩釋藥物載體[5]。

P407是具有高度親水性三維網(wǎng)絡結構的凝膠基質，可在陰道、子宮頸形成黏液層，起到化學物理屏障作用，同時，良好的黏膜表面生物黏附性和組織相容性及獨特的溶液-凝膠轉化性質使其具有制備簡單、使用方便、與用藥部位（陰道黏膜）親和力強、滯留時間長等特點[6-7]。這是交聯(lián)結構水溶性凝膠無法比擬的優(yōu)點[8-9]。此外，由于P407可以把親水性藥物分布在膠束外的自由溶液中，而把脂溶性藥物包裹在膠束內部。因此，藥物對P407的影響以及藥物的釋放行為和相轉變性的研究就顯得非常必要[10]。而且，P407中藥物釋放量隨著凝膠被陰道液稀釋逐漸溶出，進入陰道組織間液體，可以在給藥局部維持較高的濃度，適用于陰道用藥，近年來亦有報道[11]。

作者在前期研究中[12-13]，通過ME技術制備NFVR/ME-TISG，研究凝膠中NFVR/ME的穩(wěn)定性以及凝膠的流變性。本文作者嘗試以NFVR為模型藥物制備固體脂質體納米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）O/W型微乳，將NFVR/ME與P407制成熱敏原位凝膠（thermosensitive in situ gel，TISG），考察其相轉變過程和微乳中NFVR的釋藥行為，為將NFVR/ME-TISG研發(fā)成為陰道殺微生物劑提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

Kinexus Pro 高級旋轉流變儀（英國Malvern公司），動態(tài)激光散射粒度儀（英國Malvern儀器公司），透射電子顯微鏡（美國FEI公司），Ultra-cell超聲儀（美國Sonicsand Materials公司），THZ-Q臺式冷凍恒溫振蕩器（華美生化儀器廠），UV-2012 PC型紫外分光光度計（龍尼柯上海儀器有限公司），AX-20S電子天平（梅特勒-托利多儀器上海公司），XW-80A型漩渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司），SB3200水浴式超聲儀（上海必能超聲有限公司）。

泊洛沙姆407（Poloxamer407，P407，德國BASF公司），尼非韋羅（nifeviroc，上海靶點藥物有限公司，批號20110517，純度質量分數(shù)為99.5%），羥丙甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC K4M，美國DOW化學公司），蓖麻油 （castor oil，日本Kawaken 公司），聚氧乙烯35蓖麻油（cremophor EL，德國BASF公司），聚乙二醇400（PEG400，日本SANYO公司），實驗所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 NFVR/ME-TISG的制備

按文獻[14]選用溫控相圖方法實現(xiàn)高溫（75℃)制備NFVR/ME。以質量比為1.0∶3.0∶1.5比例稱取處方量藥用級蓖麻油、聚氧乙烯35蓖麻油和聚乙二醇400混合均勻，加入一定量NFVR置于75℃水浴加熱，1 000 r·min-1磁力攪拌使其溶解作為油相，邊攪拌邊緩慢滴加75℃ 0.1 mol·L-1醋酸緩沖液（pH=4.0），冷卻至室溫即得NFVR/ME（A液）。稱取處方量的P407、HPMC和甘油加入A液中，繼續(xù)攪拌使其分散均勻，然后置于4～7℃冷室，直至聚合物充分溶脹（約48～72 h），即得透明均勻略帶淡藍色乳光的NFVR/ME-TISG，室溫放置備用。

2.2 制備模擬陰道液（simulated vaginal fluid，SVF）

在1 L純水中分別加入以下物質[15]（g）：NaCl（3.51）、KOH（1.40）、Ca(OH)2（0.22）、牛血清白蛋白（0.018）、乳酸（2.00）、醋酸（1.00）、甘油（0.16）、尿素（0.40）以及葡萄糖（5.00），溶解，用HCl調節(jié)pH至4.2。

2.3 粒徑、ζ電位及形態(tài)測定

取適量NFVR/ME TISG用去離子水稀釋適宜倍數(shù)，混勻，用動態(tài)激光散射粒度儀測定微乳粒徑與ζ電位；同樣，把稀釋樣品滴加在銅網(wǎng)上，室溫條件下，質量分數(shù)為2%的磷酸鈉溶液染色，用透射電鏡觀察所得NFVR/ME的微觀形態(tài)。

2.4 相轉變性研究

2.4.1 動態(tài)應變掃描檢測凝膠溫度和相轉變溫度

取NFVR/ME TISG 溶液1 mL，加入高級旋轉流變儀測試盤，應變1.0%，溫度精確控制在 ± 0.1℃內，升溫范圍為10～45℃，震蕩頻率為1.0 Hz，升溫速度為1℃·min-1。以復數(shù)模量（G※）和復數(shù)黏度（η※）為指標，當η※= G※時，所對應的溫度為為相轉變溫度（sol-gel transition temperature，Ts-g），另外，當η※和G※達到最高值時，所對應的溫度為膠凝溫度（gelation temperature，GT）。

2.4.2 穩(wěn)態(tài)剪切速率掃描

采用Kinexus Pro 高級旋轉流變儀，吸1.0 mL NFVR/ME-TISG加入流變儀試盤。溫度控制系統(tǒng)：Peltier 平板溫度控制單元；測量夾具：CP2/50椎板，直徑50 mm，椎角2°。樣品的溫度精確控制在±1℃內，頻率1 Hz應變0.05%。分別在20、25、30和35℃條件下，剪切速率范圍0.1～1000 S-1，測定凝膠的復數(shù)粘度與剪切速率曲線[16]。

2.5 凝膠溶蝕動力學檢測

無膜溶出模型研究凝膠的溶蝕動力學[17]。精密稱取4℃的NFVR/ME-TISG（批號20111105）約5 g小心地加入到預先稱重的玻璃平底容器中。在（37.0 ± 0.5)℃的恒溫水浴振動器中預熱10 min，使熱敏凝膠溶液完全形成凝膠。然后加入37℃的體積分數(shù)為0.1%的甲醇模擬陰道液（SVF，pH4.2）2.4 mL作為釋放介質，用頻率100 r·min-1，振幅2.5 cm，恒溫振蕩30 min，立刻傾出全部釋放介質，擦干容器，迅速稱重并記錄其質量，然后重復操作，直至剩余凝膠不足最初量的10%為止。相鄰時間點樣品的質量差異為在此期間的凝膠溶蝕量，并計算出累積溶蝕率：

式中：mo為加入介質前凝膠與容器的總重量（g），mi為第i次稱重時凝膠與容器的總質量（g），mn為第n次稱重時凝膠與容器的總質量（g）與Q對時間作圖。

以Q為縱坐標，時間（t）為橫坐標作圖，得到凝膠經(jīng)時溶蝕曲線。每次實驗重復3次，結果取平均值。

2.6 凝膠中NFVR/ME釋放度考察

在考察凝膠溶蝕動力學的同時測定NFVR/ME中NFVR的釋放[18]。取溶蝕行為考察得到的釋放介質樣品2.0 mL，用體積分數(shù)為0.1%的甲醇SVF稀釋至10 mL，超聲振蕩破壞其中的微乳以釋放藥物。經(jīng)0.25 μm一次性無菌針頭濾器過濾后，按照“2.7”條操作，記錄測得的吸光度（A），由標準曲線方程求得釋放介質中NFVR的含量，計算各時間點的累積藥物釋放量。

2.7 NFVR含量測定

2.7.1 檢測波長的選擇

按“2.1”條方法制備含1.0 g·L-1的NFVR/ME-TISG和空白微乳TISG作對照參比。在20℃精密吸取1.0 mL TISG溶液于10 mL量瓶中，加體積分數(shù)為0.1%的甲醇SVF定容至刻度，水浴超聲振蕩破壞其中微乳以釋放NFVR，過濾，取續(xù)濾液為待測液。在200～400 nm進行紫外掃描?？梢娫?70.55 nm處有最大吸收波長，且空白對照在此無干擾，已知原料藥NFVR最大吸收峰是272 nm[19]，因此，在實際檢測中，以272 nm為體外釋藥的檢測波長。

2.7.2 標準曲線的建立

取干燥至恒重的NFVR原料藥對照品10 mg精密稱量，置于50 mL量瓶中，加體積分數(shù)為0.1%的甲醇SVF定容，制成200 mg·L-1標準貯存液。用標準貯存液分別配置濃度為1、2、4、8、20、40、50、60、70 mg·L-1的NFVR溶液，按照紫外-可見分光光度法（《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄IVA）以釋放介質為空白參比，在272 nm測吸光度（A），以吸光度（A）為縱坐標，以質量濃度（ρ）為橫坐標。采用最小二乘法，以A對質量濃度ρ擬合校準標準曲線，進行線性回歸，采用Stata軟件分析得工作曲線方程：

該方程表明NFNR質量濃度在1～70 mg·L-1內有良好的線性關系。最小檢測量為1.0 mg·L-1。

2.7.3 分析方法的確證

依據(jù)“2.7.1”條，配制NFVR線性范圍內低、中、高（20、40、60 mg·L-1）的樣品，每一質量濃度制備并在日內測定5份樣品；3 d連續(xù)制備并每日測定5個分析批，計算回收率及日內、日間相對標準偏差。結果日內RSD＜1.7%，日間RSD＜2.5%，本法的精密度符合要求。同時，測得高、中、低3個濃度樣品的回收率平均為100.07%，平均RSD＜2%，該方法可靠且重現(xiàn)性較好。另外測定擬定臨床用樣品（1.0 g·L-1的NFVR/ME-TISG）NFVR含量為（0.98±0.06）g·L-1(n=3)。因此，本法可用于TISG樣品中NFVR含量測定。

3結果與討論

3.1 不同含藥量的NFVR/ME 對粒徑、ζ電位及形態(tài)的影響

由表1可知，當含藥量在0.5～1.5 g·L-1時，凝膠中微乳的平均粒徑（particle size,d）和ζ電位無明顯變化。用透射電鏡觀察所得微乳的微觀形態(tài)呈完整均一的球體，分散性良好（圖1）。TISG中微乳粒徑大小(d)和ζ電位及形態(tài)時評價微乳分散體系物理穩(wěn)定性的重要指標，是表示帶電微粒間相互作用力大小的重要參數(shù)，表1和圖1說明，TISG中的NFWR/ME穩(wěn)定性較好，微乳未被破壞。

表1 不同濃度的NFVR對微乳平均粒徑、ζ電位的影響Table1 Average particle size (Z-Ave) and ζ potential of micro emulsion with different concentration of NFVR

圖1 NFVR/ME-TISG的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy image of NFVR/ME-TISG

3.2 NFVR/ME-TISG相轉變溫度和膠凝溫度的確定

膠凝溫度（gelation temperature，GT）是凝膠體系中膠束聚集，已形成半固體狀凝膠時的溫度，而非形成凝膠的起始溫度。采用Kinexus Pro高級旋轉流變儀進行動態(tài)應變掃描不僅可測得GT，而且還能獲得相轉變溫度。由于原位凝膠是高分子溶液具有粘性溶液和彈性固體的特征，本文作者采用復數(shù)黏度（η※）和復數(shù)模量（G※）2個參數(shù)隨NFVR/ME-TISG溫度從10℃升溫至45℃的變化趨勢，表征TISG的穩(wěn)態(tài)黏彈性。由圖2可見，TISG的η※和G※隨溫度上升均呈S形曲線，室溫或較低溫度下成液態(tài)，η※和G※值很低，分別為0.2和1.0 Pa·s；當溫度升高至27～28℃后，η※和G※值呈指數(shù)增加，當TISG的η※= G※時，彈性愈加明顯，為溶液形成凝膠的起始溫度，即Ts-g為29.5℃。若溫度繼續(xù)升高，約5、6個溫度單位，TISG顯示出固態(tài)特征，進入平臺期，為溶液形成半固體凝膠的溫度，即GT為34.5℃。此時η※和G※可達到最高值，分別為845 Pa·s和100 Pa·s。當溫度上升超過37℃，曲線急速下滑。

圖2 NFVR/ME-TISG的相轉變過程Fig. 2 Phase transition of NFVR/ME-TISG

復數(shù)模量是剪切模量的一種數(shù)學表示，為彈性模量（elastic modulus，G′）與黏性模量（viscousmodulus，G′）之和，是同一種黏彈性質不同角度的描述，它們不是相互獨立的，而都是角頻率ω的函數(shù)，并具有一定的換算關系。當η※和G※達到GT（34.5℃）時，膠束堆積越緊密，能形成的凝膠強度較大，在陰道內的成型性更好。

3.3 溫度及剪切速率對復數(shù)粘度（η※）的影響

溫度對NFVR/ME-TISG溶液的復數(shù)粘度η※曲線的影響見圖3，在環(huán)境溫度低于制劑相轉變溫度（Ts-g，30℃）時，如20、25℃時，η※值較小，前者維持在0.1 Pa·s，后者的η※值略有升高，亦只維持在0.5 Pa·s左右。此時η※不隨剪切率變化而改變，呈現(xiàn)典型的牛頓流體特征。在30℃時，由于達到Ts-g，η※可陡然增大到100 Pa·s，在35℃時，η※最高可達到500 Pa·s，此時η※隨剪切速率的升高而迅速減小，呈現(xiàn)出假塑性流體中特有的剪切變稀現(xiàn)象[20]。

各種生理溫度條件下的黏度直接關系到本品制劑使用過程中患者順應性和體內的治療效果，因而粘度對本品制劑在由溶液向凝膠轉變的過程中，其流變學性質以復數(shù)黏度（η※）的變化描述更為準確。

TISG中的泊洛沙姆在凝膠溶液中生成的疏水性PPO嵌段位內核，包裹著親水性PEO外殼的球狀膠束，隨著TISG溫度高于Ts-g（30℃）時，締結在泊洛沙姆的疏水性PPO鏈段上的水分子將不斷脫去，形成更多膠束；溫度進一步升高（＜37℃），其中親水性PEO鏈段也脫去水分子，互相纏結堆砌，形成半固體狀的TISG。此時，膠束之間發(fā)生相互聚集增強，內摩擦力勢必增大。由于剪切力可破壞TISG的結構，使膠束和單體數(shù)目增多，聚集減少，出現(xiàn)圖3所示的假塑性流體特有的剪切變稀現(xiàn)象，與文獻[21-22]一致。

本制劑所具有的這一流變性質，推測在實際性生活時，一定的或不斷增加的剪切速率可使其粘度下降，減少對陰莖抽動時的阻力，更易被使用者接受。

圖3 不同溫度時剪切速率對TISG復數(shù)黏度η※/(Pa·s)的影響Fig.3 Influence of the shear rate on the complex viscosity (η※/(Pa·s))of TISG at different temperature

3.4 凝膠溶蝕與藥物NFVR釋放隨時間的動力學特征

圖4表示當振蕩頻率為100次·min-1時，凝膠溶蝕和微乳中藥物釋放曲線。由該圖可見，無論凝膠溶蝕還是微乳中NFVR藥物的釋放行為均以恒定的速率進行，遵循零級動力學方程（Zero-onderkinetics），顯示出零級釋放行為特征，凝膠中NFVR釋放稍慢于凝膠溶蝕，NFVR在凝膠中釋放94.31%的時間約為330 min，表明凝膠溶蝕是控制NFVR釋放的主要因素，原因可分為兩點：a.泊洛沙姆熱敏制劑為水溶性凝膠，其表面遇到水性介質易被溶蝕而降解；b.NFVR是難溶性藥物，較難在水性介質（1%甲醇SVF）中發(fā)生擴散行為[22]。

圖4 凝膠溶蝕與藥物釋放隨時間的動力學特征Fig. 4 Cumulative gel dissolved versus time and cumulative drug released from gel versus time

3.5 藥物釋放與凝膠溶蝕的關系

藥物釋放與凝膠溶蝕的關系見圖5。由圖5可知，藥物的累積釋放率（cumulative drug released from gel versus time）可在凝膠的累積溶蝕率（cumulative gel dissolved from drug released versus time）增加而增加，兩者之間存在良好的線性關系（R2=0.98），說明微乳中NFVR在P407熱敏凝膠中釋放受凝膠溶蝕控制，這種釋藥方式可以避免產生突釋放效應，增強了其給藥的依從性與其他研究者的實驗結果相一致[23]，同時由于熱敏凝膠在陰道中的滯留時間較普通凝膠長，增強藥物的生物利用度和藥效。

圖5 藥物累積釋放量與凝膠的累積溶蝕量之間的關系Fig. 5 Correlation between cumulative gel dissolved and cumulative nifeviroc released

4結論

NFVR/ME為本品的主藥，與P407制成NFVR/ME-TISG。HPMC與P407合用凝膠提高了NFVR/ME的滯留性，而且室溫下具有一定的流動性和溫度敏感性。實驗表明，含NFVR/ME從熱敏原位凝膠中的釋放，受凝膠溶蝕情況的控制，隨時間呈現(xiàn)零級動力學特征。其主要原因：首先本品制劑為水溶性凝膠，其表面遇到水性溶質易被溶蝕而降解；其次，NFVR水溶性差，難在水性介質中發(fā)生擴散行為。這種由溶蝕控制藥物釋藥方式可以避免突釋效應。本品在相似陰道生理溫度（35～37℃）形成的凝膠的剪切復數(shù)粘度呈現(xiàn)頻率依賴性，能有效提高臨床使用者的順應性和可接受性。

作者認為，本制劑中P407的濃度對GT和Ts-g的作用是影響凝膠粘彈性、溶蝕速率以及NFVR釋放速率等性質的主要原因。熱敏原位凝膠是一種具有應用前景的新型陰道用釋藥系統(tǒng) 。

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In vitrodrug release and phase transition of nifeviroc microemulsion thermosensitive in situgel

WANG Yu-zhu1, ZHI Rui-na1,2, LAN Meng-ning3, YANG Kai1, LI Wei-hua1,2*, DING Xun-cheng1
（1.State Key Labs of Family Planning Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China; 2. Fudan University Medical College, Shanghai 200032, China; 3. Malvern Instruments (China) Ltd., Shanghai 200233, China)

ObjectiveTo prepare a kind of microemulsion thermosensitive in situ gel (ME-TISG) with nifeviroc（NFVR）as a model drug , and to explore its pharmaceutical properties. Methods Nifeviroc microemulsion(NFVR/ME) were prepared by temperature (75℃) control phase diagram and loaded into P407 gel. The particle size, ζ potential and morphology of the ME were analyzed by ZetePALS Zeta Potential Analyzer and Transmission Electron Microscope, and the rheology property was determined by Senior rotary rheometer. The correlation between NFVR/ME release and gel dissolution under a frequency of 100 r·min-1was studied using non-membrane model. Results Average particle size of different concentration NFVR/ME was 36.30-38.25 nm and ζ potential was -7.15--7.22 mV. It showed that the micromorphology of ME was in round flat sphere shape. Sol-gel transition temperature and gelation temperature of the TISG was 29.5℃ and 34.5℃ respectively. NFVR/ME-TISG appeared to be newtonian fluid at low temperature (＜25℃) with low viscosity. The viscosity of ME increased as temperature rose and it showed a typical pseudoplastic fluid characteristics as to 35-37℃. The complex viscosity decreased gradually with the increase of shear rate, suggesting a shear-thinning behavior. In vitro release rate of NFVR was controlled by gel dissolution rate with good linear relationship (R2=0.98), following the zero order kinetics. Such gel dissolution-controlling drug release mode can avoid burst release effect. Conclusion ME-TISG is a promising new vaginal drug delivery system.

pharmaceutics; nifeviroc; microemulsion; thermosensitive in situ gel; complex viscosity; sol-gel transition temperature; gelation temperature; in vitro drug release

R 94

A

（2014）04–0131–10

(本篇責任編輯：呂向一)

2014–02–25

國家十二五科技支撐計劃資助項目（2012BAI31B04）；十二五國家科技重大專項（2012ZX10001007-009-003）；上海市人口和計劃生育委員會（2012JG03）；十二五國家科技重大專項（子任務）（2013ZX10001006-003-002）；國家自然科學基金青年基金資助項目（81100459）

王玉柱（1985-），女（漢族），上海人，研究實習員，主要從事新藥制劑的研究，Tel. 021-64437475，E-mail wangyuzhu19850408@163.com；＊通訊作者：李衛(wèi)華（1973-），女（漢族），遼寧沈陽人，博士，研究員，主要從事計劃生育新藥的研發(fā)，Tel. 021-64437475，E-mail iamliweihua@yahoo.com。