王志昆，張 歡，孫曉巖，王東凱*

(沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

自組裝白蛋白納米粒的制備及體外釋藥行為

王志昆，張 歡，孫曉巖，王東凱*

(沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

目的以紫杉醇為難溶性藥物模型，制備自組裝紫杉醇白蛋白納米粒。方法 谷胱甘肽作為還原劑，經(jīng)細胞超聲制備白蛋白納米粒，通過正交試驗篩選出最優(yōu)處方。結(jié)果結(jié)果表明BSA濃度為1.5 g?L-1，谷胱甘肽用量為90 mg，紫杉醇/白蛋白質(zhì)量比為1∶20時，可以制備出表面圓整，粒徑為91.19 nm，zeta電位-12.8 mv，包封率為90.8%，載藥量為4.5%的紫杉醇白蛋白納米粒，體外藥物釋放符合peppas模型，n=0.29，主要以擴散釋藥為主。結(jié)論 自組裝法制備出的白蛋白納米粒粒徑均一可控，并可顯著提高白蛋白對難溶性藥物的包封率。

藥劑學(xué)；白蛋白納米粒；自組裝；紫杉醇；粒徑

蛋白質(zhì)具有無毒、生物相容性好、可降解等特點，因而備受科研工作者們的青睞。從來源上常用的有2種，即植物蛋白和動物蛋白。其中，又以人血清白蛋白和牛血清白蛋白作為藥物載體應(yīng)用的最為廣泛。2005年，由FDA批準(zhǔn)上市的用于治療乳腺癌的Abraxane?，就是以人血清白蛋白包載紫杉醇研制成功的納米制劑，其毒性小、使用方便、靶向性強，治療效果遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的Taxol??；诖搜邪l(fā)出的多西紫杉醇、雷帕霉素、烯丙基氨基格爾德霉素的白蛋白納米制劑也已進入臨床研究[1]。

常見的白蛋白納米粒制備方法為去溶劑化法和乳化超聲法[2]2種，前者應(yīng)用于難溶性藥物包封率極低，后者則因制備出的粒徑較大，且油相極難除去而受到限制。為解決上述問題，本文作者選用了來源廣泛、價格便宜的牛血清白蛋白作為難溶性藥物載體，以安全無毒的谷胱甘肽作還原劑，誘發(fā)白蛋白自組裝形成白蛋白納米粒，再經(jīng)細胞超聲粉碎進一步控制和減小粒徑。此種方法不僅可以控制粒徑在幾百納米以下，而且可以有效提高難溶性藥物的包封率。制備過程中無需使用有毒的溶劑如二氯甲烷、氯仿等，僅使用少量乙醇。另外，納米粒表面保留了豐富的游離氨基，有利于對納米粒表面進行進一步的修飾（例如聚乙二醇化、葉酸修飾等）以提高制劑的靶向性，因此本方法具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

BS110S型精密電子天平（北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司），PB-10 Sartorius 普及型pH計（德國Sartorius股份公司），Zetasizer Nano ZS90粒度測定儀（英國Malvern公司），PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠），TGL-16G臺式高速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠），JEM-100B透射電鏡（日本JEOL公司），LC-10A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

紫杉醇原料藥（武漢神曲生物化工有限公司，含量質(zhì)量分數(shù)為99%，批號∶120812），牛血清白蛋白（Ⅴ，安徽合肥Biosharp生物科技公司），透析袋（美國Viskase公司，截留相對分子質(zhì)量∶8 000～14 000），三硝基苯磺酸、氯化鈉、乙醇（分析純，市售），乙腈（色譜純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法的建立

2.2.1 高效液相色譜法測定紫杉醇含量

經(jīng)紫外掃描，確定檢測波長為227 nm。經(jīng)篩選優(yōu)化，確立流動相組成及比例為V(乙腈)：V(水)=60∶40，進樣體積10 μL，流速1.0 mL?min-1，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。該條件下，紫杉醇保留時間約8 min，溶劑、白蛋白等對紫杉醇的測定無干擾，色譜圖見圖1。經(jīng)方法學(xué)研究，紫杉醇在1.09～54.4 mg?L-1質(zhì)量濃度內(nèi)線性良好（A=38384ρ-386.27，r=0.999 9）；低（1 mg?L-1）、中（20 mg?L-1）、高（50 mg?L-1）3個質(zhì)量濃度的平均回收率為100.1%，RSD為1.21%；日內(nèi)精密度和日間精密度良好（RSD＜2.0%）；溶液室溫24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好（RSD=1.99%）。上述結(jié)果表明建立的HPLC法適用于紫杉醇含量檢測。

圖 1 白蛋白和紫杉醇白蛋白納米粒的高效液相色譜圖Fig. 1 The HPLC chromatograghs of BSA and PTX-BSA-NPs

2.2.2 包封率和載藥量的測定

取紫杉醇白蛋白納米粒適量，高速離心（15 000 r?min-1，30 min），分離得到上清液。另取納米粒適量置量瓶中，加入乙腈，超聲10 min，充分提取藥物，乙腈定容。按“2.2.1”條分別測定上清液和總的藥物濃度，計算包封率和載藥量。包封率（EE /%）=/ ρ總× 100%；載藥量式中，ρ總為總的藥物質(zhì)量濃度（g?L-1），ρ游離為游離的藥物質(zhì)量濃度為紫杉醇的加入質(zhì)量（mg），m總為載藥納米粒的總質(zhì)量（mg）。

2.2.3 表面游離氨基的測定

取0.1 g?L-1的三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid ,TNBS）溶液250 μL，加入到500 μL 0.5 g?L-1的白蛋白納米粒中，37 ℃振搖2 h。高速離心30 min（15 000 r?min-1），取上清液。用紫外分光光度計在345 nm處測定未反應(yīng)的TNBS[3-4]。另取TNBS，用重蒸水代替納米粒，同法操作。經(jīng)計算單位質(zhì)量納米粒中所含表面活性氨基的摩爾數(shù)為6.46。

2.2.4 成球率的測定

取紫杉醇白蛋白納米粒溶液適量，高速離心30 min（15 000 r?min-1），取上清液，蒸餾水稀釋適宜倍數(shù)，與考馬斯亮蘭應(yīng)用液反應(yīng)10 min，于595 nm處測定吸光度，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到未去溶劑化的BSA(bovine serum albumin)濃度[5-6]。納米粒收率(%)=(投入的BSA總量-未形成納米粒BSA量)／投入的BSA總量×100%。

2.2.5 納米粒的形態(tài)、粒徑及zeta電位

取處方優(yōu)化納米粒混懸液適量，加去離子水稀釋10倍，搖勻[7-8]。用Malvern激光散射粒度分析儀測定粒徑分布及zeta電位(見圖2)。取經(jīng)稀釋100倍的白蛋白納米?；鞈乙海祖u酸負染，透射電鏡觀察粒子形態(tài)(見圖3)。由圖3可見，納米粒呈類球形。由圖2可見，平均粒徑為91.19 nm， zeta電位為-12.8 mV，表明白蛋白納米粒比較穩(wěn)定。

圖 2 紫杉醇白蛋白納米粒的粒徑分布及zeta電位Fig. 2 Size distribution and zeta potential of PTX-BSA-NPs

圖 3 紫杉醇白蛋白納米粒的透射電鏡照片F(xiàn)ig. 3 TEM photograph of PTX-BSA-NPs

2.2.6 DSC曲線的測定

分別取紫杉醇原料藥、牛血清白蛋白、兩者的物理混合物、以及紫杉醇白蛋白納米粒粉末適量，測定DSC曲線（見圖4）。由圖可見，紫杉醇白蛋白納米粒中的DSC曲線未出現(xiàn)紫杉醇（223.9 ℃）的吸收峰，而且有新的吸收峰（216.3 ℃）出現(xiàn)，因此說明紫杉醇被白蛋白包裹，納米粒形成。

圖 4 差示掃描量熱法分析結(jié)果Fig. 4 The results of DSC analysis

2.2 紫杉醇白蛋白納米粒的制備

稱取牛血清白蛋白（BSA）20 mg，加入20 mL 0.01 mol?L-1的磷酸鹽緩沖溶液（pH8.0），超聲2 min，使白蛋白充分溶解。置于75 ℃的水浴鍋中，預(yù)熱5 min。攪拌下加入紫杉醇的乙醇溶液100 μL（10 g?L-1），隨即加入100 mg谷胱甘肽，充分攪拌，使溶解，保持反應(yīng)體系15 min。細胞超聲（700 W，超聲時間3 s，間隔2 s）20次，將納米粒轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析10 h，除去殘留的谷胱甘肽和游離藥物。

2.3 處方篩選及優(yōu)化

經(jīng)過單因素初步考察，確定影響紫杉醇白蛋白納米粒的粒徑和包封率的主要因素為牛血清白蛋白的濃度，谷胱甘肽濃度及紫杉醇/牛血清白蛋白的比例。采用正交試驗設(shè)計L9（34）對處方做進一步的篩選。各因素及水平見表1。

表 1 正交設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

以包封率及粒徑為主要評價指標(biāo)，正交試驗結(jié)果如表2。

表 2 正交設(shè)計粒徑和包封率的結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental results of particle size and EE%

對正交實驗表進行極差分析可知，對于粒徑來說, 各因素影響的主次順序是A> C > B，由此得出各因素的最優(yōu)化組合為A1C2B2。對于包封率來說, 各因素影響的主次順序是 C>A>B，最優(yōu)化組合為C2A2B2.。綜合分析，在粒徑滿足要求的前提下，為獲得更高的包封率，因此最終優(yōu)選組合為C2A2B2.。即蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度1.0 g?L-1，谷胱甘肽5 g?L-1，紫杉醇和白蛋白的質(zhì)量比為1∶20時，可以獲得最優(yōu)處方。根據(jù)所篩選的最優(yōu)處方，制備3批納米粒，制備出的紫杉醇白蛋白納米粒的平均粒徑為(91.19 ±2.30) nm，zeta電位(-12.8±0.8) mv，包封率為90.8%，載藥量為4.5%，收率為92.3%。說明該處方工藝制備穩(wěn)定，可重復(fù)性強。

2.4 體外釋放曲線

移取3份5 mL最優(yōu)處方紫杉醇白蛋白納米粒于透析袋中，置于80 mL含1 g?L-1吐溫80的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的釋放介質(zhì)中[9-10]，37 ℃恒溫水浴攪拌，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、36和48 h取出1 mL溶液 (補加1 mL釋放介質(zhì))，樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，并按“2.2.1”條件測定紫杉醇含量，然后計算累積釋放量，繪制釋放曲線。見圖5。然后將此釋藥數(shù)據(jù)分別用零級、一級、Higuchi以及Peppas方程擬合，結(jié)果可見，以Peppas（n=0.29）方程擬合較佳 (見表3)。n=0.29表明該制劑體外釋放以擴散機制為主。

圖 5 紫杉醇納米粒在含1 g?L-1吐溫80的pH7.4磷酸鹽緩沖液中的釋放曲線（n=3）Fig. 5 The release profile of PTX from NPs in 1 g?L-1 Tween80 phosphate buffer（pH=7.4，n=3）

表 3 最優(yōu)處方釋放曲線的擬合結(jié)果Table 3 Models of release fitting and correlation coefficient of the optimized formulation

3 討論

有文獻報道，以2-巰基乙醇作還原劑[10-13]，制備載藥白蛋白納米粒。但是2-巰基乙醇的毒性極大，并不適用于藥物制劑的制備。因此，本研究中,作者選用安全無毒的谷胱甘肽作為體系的還原劑，誘導(dǎo)BSA自組裝形成白蛋白納米粒。

谷胱甘肽具有良好的還原特性，加熱條件下可以使BSA中的二硫鍵打開，從而引發(fā)BSA的空間構(gòu)型的改變。這種空間構(gòu)型的變化，促使BSA的疏水性基團暴露出來，此時疏水性藥物（如PTX）通過疏水作用迅速地與BSA順利的結(jié)合。隨著體系溫度的降低，反應(yīng)終止，此時二硫鍵重新形成，BSA包載疏水性藥物形成納米粒。再經(jīng)過細胞超聲的作用，同樣地，產(chǎn)生出的能量可將納米粒粒徑進一步減小，且更加均一穩(wěn)定。有研究表明[11]，藥物的加入量直接影響著藥物在載體中的存在方式，即載藥量較小時，BSA包裹藥物形成實心球，形成一種殼-核的結(jié)構(gòu)；而載藥量進一步增大，藥物和載體形成一種結(jié)合物，沒有明顯的殼-核結(jié)構(gòu)。

與傳統(tǒng)方法相比，本研究中,作者所用制備工藝更加簡單，且沒有使用有毒試劑（如戊二醛、二氯甲烷、2-巰基乙醇等），而且乙醇用量極低，在反應(yīng)體系加熱過程中基本上揮發(fā)完全，因此更加安全。更突出的是對疏水性藥物極高的包載率，可達90%以上，這是傳統(tǒng)的去溶劑化法很難達到的。另外該方法基本不會破壞BSA的結(jié)構(gòu)，由于沒有使用交聯(lián)劑，很好地保留了白蛋白表面的游離氨基，因此有利于制劑的進一步修飾，增加制劑的靶向性延長藥物的循環(huán)時間。

由釋放曲線可見，市售紫杉醇注射液在10 h左右釋放完全。而所制得的PTX-BSA-NPs體外釋放具有明顯的緩釋特征。在0.5 h內(nèi)的釋放量在10%（＜40%）左右，這主要與BSA靠近表面的藥物釋放有關(guān)，20 h過后釋藥逐漸趨于平緩，24 h累積釋藥量基本保持不變，達到40%左右。此時，包裹在BSA內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)中的藥物并未完全釋放，隨著BSA在更強的條件（例如酶的降解作用）下不斷降解，釋藥可能會更加的完全。釋放曲線經(jīng)peppas模型擬合，計算n=0.29，進一步說明所制備的白蛋白納米粒釋放藥物是以擴散為主的釋藥行為。

4 結(jié)論

本研究中,作者以紫杉醇為疏水性藥物模型，經(jīng)處方篩選優(yōu)化制備出的自組裝白蛋白納米粒，具有外形圓整、粒徑均一和高包封率的特點，適用于難溶性藥物的白蛋白納米制劑的制備。

[1] CHETAN Y, DIPESH B, IMRAN V, et al. Proteins∶ emerging carrier for delivery of cancer therapeutics-a review [J]. Expert Opin Drug Deliv, 2013, 10(10)∶ 1429-1447.

[2] WEBER C, KREUTER J, LANGER K. Desolvation process and surface characteristics of HSA-nanoparticles[J]. Int J Pharm, 2000, 196(2)∶ 197-200.

[3] HASAN K, SEYED A S, AMIR M, et al. Optimization of PEGylation conditions for BSA nanoparticles using response surface methodology[J]. AAPS PharmSciTech, 2013, 3(11)∶ 1206-1211.

[4] 張良珂, 侯世祥, 宋相容, 等. 一種白蛋白納米粒的制備與評價[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2007, 5(42)∶365-367.

[5] 張曉燕, 平其能. 多西紫杉醇白蛋白納米粒的制備及體外評價[J]. 藥學(xué)進展, 2008, 5(32)∶223-227.

[6] 王孝平, 邢樹禮. 考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J]. 天津化工, 2009 3(23)∶40-41.

[7] ULBRICH K, MICHAELIS M, ROTHWEILER F, et al. Interaction of folate-conjugated human serum albumin (HSA) nanoparticles with tumour cells [J]. Int J Pharm, 2011, 406(1-2)∶ 128-134.

[8] JUN J Y, NGUYEN H H, PAIK S, et al. Preparation of size-controlled bovine serum albumin (BSA) nanoparticles by modified desolvation method [J]. Food Chem, 2011, 127(4)∶ 1892-1898.

[9] WANG Hai, ZHAO Ying WU Yan, et al. Enhanced anti-tumor efficacy by co-delivery of doxorubicin and paclitaxel with amphiphilic methoxy PEG-PLGA copolymer nanoparticles [J]. Biomaterials, 2011, 32(32)∶ 8281-8290.

[10] YUAN A-hu, WU Jin-wei, SONG Chen-chen, et al. A novel self-assembly albumin nanocarrier for reducing Doxorubicin-mediated cardiotoxicity[J]. J Pharm Sci, 2013, 102(5)∶ 1626-1635.

[11] JIANG Li-qun, XU Yi-sheng, LIU Qi, et al. A nontoxic disulfide bound reducing method for lipophilic drug-loaded albumin nanoparticle preparation∶Formation dynamics, influencing factors and formation mechanisms investigation [J]. Int J Pharm, 2013, 443(1-2) ∶80-86.

[12] GONG Guang-ming, ZHI Feng, WANG Kai-kai, et al. Fabrication of a nanocarrier system through self-assembly of plasma protein and its tumor targeting[J]. Nanotechnology, 2011, 22(29) ∶295603.

[13] GONG Guang-ming, XU Yan, ZHOU Yuan-yuan, et al. Molecular switch for the assembly of lipophilic drug incorporated plasma protein nanoparticles and in vivo image[J]. Biomacromolecules, 2012, 13(1) ∶23-28.

Fabrication of albumin nanoparticles through self-assembly and its in vitro release characteristics

WANG Zhi-kun, ZHANG Huan, SUN Xiao-yan, WANG Dong-kai*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveTo fabricate albumin nanoparticles through self-assembly of BSA, using paclitaxel as a model drug. Methods Glutathione was applied as reducing agent to prepare albumin nanoparticles through ultrasonic cell disrupting, and orthogonal design was used to optimize the formulation. Results Spherical paclitaxel albumin nanoparticles were made with mean particle size 91.19 nm , Zeta potential -12.8 mv , drug entrapment efficiency 90.8% and drug loading 4.5%.The mechanism of release was drug diffusion from matrix by fitting drug release data with Peppas model. Conclusion Albumin-bound hydrophobic drug nanoparticles with controlled particle size and high encapsulation efficiency were obtained through self-assembly method.

pharmaceutics; albumin nanoparticles; self-assembly method; paclitaxel; particle diameter

R 943

A

（2014）04–0115–08

(本篇責(zé)任編輯：曹霞)

2014–03–21

王志昆(1988–)，女(漢族)，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，E–mail zhikunmishu@163.com；*通訊作者：王東凱(1962–), 男(漢族)，遼寧沈陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型的研究, Tel. 024-23986310, E–mail wangycsyphu@126.com。