鄒 蕾，黃志遠(yuǎn)，崔 巖，高 燕

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，遼寧沈陽 110016

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由于多種因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成肺間質(zhì)及肺泡彌漫性水腫，進(jìn)而導(dǎo)致急性呼吸功能不全［1］。ALI是導(dǎo)致急重癥患者死亡的常見原因之一，ALI患者死亡率極高，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的干預(yù)措施［2］。因此，尋找有效的治療藥物是治療急性肺損傷亟待解決的難題之一。近年來研究核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路是炎癥反應(yīng)發(fā)生的中樞環(huán)節(jié)之一，它在ALI-急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［3，4］。雷公藤多苷(tripterygium glycosides，GTW)具有明顯的抗炎、免疫抑制、抗生育及抗腫瘤活性作用，含雷公藤多甘的中藥制劑常用于治療關(guān)節(jié)炎、自身免疫性紊亂、器官移植、糖尿病腎病、哮喘及腫瘤等多種疾病抗氧化、抗炎、抗黏附作用［5，6］。然而，雷公藤多苷對(duì)急性肺損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制ALI模型，旨在研究雷公藤多苷對(duì)急性肺損傷的保護(hù)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 脂多糖、鼠抗NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗IGg(美國Sigma公司)。二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(中衫金橋試劑公司)。雷公藤多苷(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司)。血?dú)夥治鰞x(美國Nova Biomedical);Olympus生物顯微鏡，Image Pro Plus數(shù)碼顯微鏡照相分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 建立急性肺損傷模型 60只雄性清潔級(jí)Wistar大鼠，體重200～220 g，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(NS組)、急性肺損傷組(LPS組)和雷公藤多苷干預(yù)組(GTW組)。實(shí)驗(yàn)過程中，LPS組和GTW組分別通過股靜脈注射5 mg/kg LPS，建立急性肺損傷模型。GTW組在注射LPS前30 min，靜脈注射10 mg/kg GTW，NS組和LPS組給予等量生理鹽水。

1.2.2 測(cè)定動(dòng)脈氧分壓 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血0.5 ml，采用血?dú)夥治鰞x測(cè)定各組動(dòng)物的PaO2。

1.2.3 標(biāo)本采集 造模后9 h，采用戊巴比妥鈉2.0 mg/kg腹腔麻醉大鼠，逐層解剖大鼠胸部組織，分離肺臟，剔除結(jié)締組織，用生理鹽水清洗血液，用分析天平稱重。分離右肺上葉，用10%甲醛溶液固定，用于病理形態(tài)學(xué)觀察;將剖取的右肺下葉置于-80℃液氮罐中，用于檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)。

1.2.4 肺組織濕/干重比(W/D) 稱取左上肺濕重后，將其置于65℃恒溫烤箱中，烘烤48 h，待其重量穩(wěn)定后，稱量肺臟干重，計(jì)算肺濕/干重比。

1.2.5 炎癥細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA方法，檢測(cè)肺組織勻漿液中炎癥因子表達(dá)，組織勻漿液的制備過程參照說明書。炎癥因子IL-β、IL-6、IL-10及TNF-α檢測(cè)及濃度計(jì)算參考試劑盒說明書。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 提取大鼠肺組織總蛋白用于肺組織中NF-κB和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)表達(dá)檢測(cè)。取30 mg肺組織于500 μl瑞帕(RIPA)中勻漿，并加入5 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑混合物，0℃條件下勻漿20 min，勻漿后14 000 r/min離心15 min，取400 μl上清液備用。Western blot實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行?？筃F-κB抗體工作稀釋度為1：500，抗GAPDH為1：500;二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗為1：1 000。使用軟件計(jì)算NF-κB灰度值比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用(±s)表示，定量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈PaO2分析結(jié)果 LPS注射后大鼠呼吸、心率明顯增快，反應(yīng)淡漠，精神萎靡。與對(duì)照組相比，LPS組PaO2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而GTW組PaO2較LPS組有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 肺組織濕/干重(W/D)比值測(cè)定 LPS組大鼠肺濕干比W/D值，較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而GTW組肺濕干比W/D值明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下，對(duì)照組肺泡間隔厚度適中，肺泡壁完整，間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1A)。LPS組與對(duì)照組相比，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔有滲出物，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤明顯(圖1C)。GTW組肺組織存在淤血、出血及間隔增寬等現(xiàn)象，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤，肺損傷程度較LPS組減輕(圖1E)。

2.4 肺組織NF-κB免疫組化表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，NF-κB在對(duì)照組肺組織沒有表達(dá)(圖1B)。LPS組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖1D)，GTW組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)較LPS組降低(圖1F)。

圖1 各組病理形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)果比較

2.5 炎癥因子表達(dá)檢測(cè) 與對(duì)照組相比，LPS組促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)明顯升高，而抑炎因子IL-10水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組相比，GTW組上述炎癥因子表達(dá)明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組炎性因子表達(dá)比較

2.6 NF-κB蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，LPS組大鼠NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與LPS組比較，GTW組大鼠NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

3 討論

急性肺損傷是指肺內(nèi)外各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，急性呼吸困難、難治性低氧血癥和雙側(cè)肺部浸潤性病變是其典型表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，LPS可以導(dǎo)致急性肺損傷大鼠動(dòng)脈血?dú)釶aO2明顯降低，肺組織濕/干重比升高，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔可見滲出物，間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤等典型的肺損傷改變，同時(shí)導(dǎo)致促炎癥因TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，而抑炎因子IL-10水平明顯下降。TNF-α、IL-1β、IL-6是人體重要的抗炎因子，在炎癥發(fā)生中這些因子表達(dá)明顯升高，而IL-10則是重要的抗炎因子之一，其高表達(dá)可抑制炎性反應(yīng)，保持炎癥反應(yīng)在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡［7］。急性肺損傷時(shí)抗炎因子分泌量明顯減少，不能有效的對(duì)拮抗炎性因子所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在肺間質(zhì)內(nèi)的大量浸潤、組織水腫、器官功能損害，極大地增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道顯示，急性肺損傷死亡患者的疾病初期，可發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中的IL-10濃度較低［8-10］。結(jié)果提示，IL-10蛋白分泌降低可能是導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子表達(dá)增多及肺內(nèi)炎癥反應(yīng)加重的主要原因。

圖3 各組NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

雷公藤是最常見的中藥之一，具有活血通絡(luò)、消腫止痛等功效，在臨床上多用于治療類風(fēng)濕、腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾?。?1，12］。研究證實(shí)，雷公藤具有較好的抗腫瘤、抗炎及抗氧化等作用，而雷公藤多苷是從雷公藤的去皮根部提取的總苷，是其主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷通過抑制NF-κB蛋白，促進(jìn)前列腺癌的凋亡［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤多苷抑制糖尿病腎病大鼠炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到減輕腎病的效果［14］。雷公藤多苷可以減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，明顯改善大鼠的肺功能，機(jī)制可能與上調(diào)改善 IL-10、Foxp3和下調(diào) TNF-α表達(dá)密切相關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷可明顯改善急性肺損傷大鼠的動(dòng)脈血PaO2水平，降低肺臟濕/干重比，改善肺組織病理學(xué)改變，下調(diào)TNF-α、IL-1β及IL-6和上調(diào)IL-10蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LPS組NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，而雷公藤多苷明顯降低肺組織NF-κB蛋白表達(dá)。使肺損傷程度減輕。NF-κB可以與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的核因子，經(jīng)典的NF-κB是p65/p50二聚體結(jié)構(gòu)，NF-κB激活后可以促進(jìn)TNF-α等炎癥因子的生成，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)［16］。研究證實(shí)，LPS通過激活NF-κB蛋白誘發(fā)大量促炎因子生成是急性肺損傷發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，NF-κB激活是炎癥反應(yīng)蛋白表達(dá)的終末控制點(diǎn)，故降低NF-κB活性可能是治療ALI的一個(gè)有效方案［17］。本研究表明，雷公藤多苷可明顯減輕LPS導(dǎo)致的肺部急性炎性反應(yīng)，其保護(hù)機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。雷公藤多苷具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值，并為其治療提供新的理論依據(jù)。

［1］Griet M，Zelaya H，Mateos MV，et al.Soluble Factors from Lactobacillus reuteri CRL1098 Have Anti-Inflammatory Effects in A-cute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide in Mice［J］.PloS One，2014，9(10):e110027.

［2］Dong H，Shan F，Sun Q，et al.The cyclic hexapeptide AcF attenuates sepsis-induced acute lung injury and mortality in rats［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014 ，18(18):2727-2735.

［3］Li X，Liu Z，Jin H，et al.Agmatine Protects against Zymosan-Induced Acute Lung Injury in Mice by Inhibiting NF-kappaB-Mediated Inflammatory［J］.Biomed Res Int，2014，2014:583736.

［4］Santos LA，Ribeiro EL，Barbosa KP，et al.Diethylcarbamazine inhibits NF-kappaB activation in acute lung injury induced by carrageenan in mice［J］.Int Immunopharmacol，2014，23(1):153-162.

［5］Wan Y，Gu L，Suzuki K，et al.Multi-glycoside of Tripterygium wilfordii Hook f.ameliorates proteinuria and acute mesangial inju-ry induced by anti－ Thy1.1 monoclonal antibody，Nephron Experimental nephrology［J］.Nephron Exp Nephrol，2005，99(4):e121－e129.

［6］Xue M，Jiang ZZ，Liu JP，et al.Comparative study on the antiinflammatory and immune suppressive effect of Wilforlide A.Fitoterapia［J］.Fitoterapia，2010，81(8):1109 － 1112.

［7］Dhande I，Ma W，Hussain T.Angiotensin AT receptor stimulation is anti－inflammatory in lipopolysaccharide－activated THP－1 macrophages via increased interleukin－10 production，Hypertension research:official journal of the Japanese Society of Hypertension［J］.Hypertens Res，2014 Sep 11.［Epub ahead of print］

［8］Aeffner F，Woods PS，Davis IC.Activation of A1 － adenosine receptors promotes leukocyte recruitment to the lung and attenuates acute lung injury in mice infected with influenza A/WSN/33(H1N1)virus［J］.J Virol，2014 ，88(17):10214 － 10227.

［9］Wang L，Chen J，Wang B，et al.Protective effect of quercetin on lipopolysaccharide－induced acute lung injury in mice by inhibiting inflammatory cell influx［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2014 Jun 9.［Epub ahead of print］

［10］Wang Y，Ji M，Wang L，et al.Xuebijing injection improves the respiratory function in rabbits with oleic acid－induced acute lung injury by inhibiting IL－6 expression and promoting IL－10 expression at the protein and mRNA levels［J］.Exp Ther Med，2014，8(5):1593 －1598.

［11］Landewé RB，van der Heijde D.Comment on:comparison of Tripterygium wilfordii Hook F with methotrexate in the treatment of active rheumatoid arthritis(TRIFRA):a randomised，controlled clinical trial［J］.Ann Rheum Dis，2014，73(10):e62.

［12］Marcus DM.Comparison of Tripterygium wilfordii Hook F with methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2014，73:e56.

［13］Kiviharju TM，Lecane PS，Sellers RG，et al.Antiproliferative and proapoptotic activities of triptolide(PG490)，a natural product entering clinical trials，on primary cultures of human prostatic epithelial cells［J］.Clin Cancer Res，2002，8(8):2666 －2674.

［14］Liu G，Shen Y，You L，et al.Tripterygium wilfordii polyglycoside suppresses inflammatory cytokine expression in rats with diabetic nephropathy［J］.Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2014，30(7):721 －724.

［15］Li G，Ren J，Wang G，et al.T2 enhances in situ level of Foxp3+regulatory cells and modulates inflammatory cytokines in Crohn＇s disease［J］.Int Immunopharmacol，2014，18(2):244 － 248.

［16］Wang XD，Zhu L，Cai YH，et al.Prokaryotic expression of pig nuclear transcription factor－kappaB p65/p50 and its impacts on PRRSV proliferation［J］.Chinese Journal of Virology，2013，29(6):621－631.

［17］Romay MC，Che N，Becker SN，et al.Regulation of NF － kappaB signaling by oxidized phospholipid and IL－1beta induced miRs－21 －3p and －27a－5p in human aortic endothelial cells［J］.J Lipid Res，2014 Oct 19.［Epub ahead of print］