穆向榮， 馬逾英， 袁茂華， 馬 羚， 蔣桂華， 曹 赟

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥品種質(zhì)量鑒定科研三級實(shí)驗(yàn)室，成都611137

川芎為常用中藥，來源于傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有活血祛瘀、行氣開郁、止痛等功效［1］。川芎除供藥用外，還可用作食品、美白護(hù)膚品、洗頭液、飼料和煙用香料添加劑等［2］，應(yīng)用范圍廣泛，需求量大。川芎目前均為人工栽培，在生長過程中，易遭受多種蟲害，特別是蠐螬、川芎莖節(jié)蛾咬食川芎莖干和根莖，對川芎產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大威脅。據(jù)調(diào)查，目前在川芎生產(chǎn)過程中，產(chǎn)地藥農(nóng)多使用毒死蜱來防治蟲害。

毒死蜱(chlorpyrifos)，化學(xué)名稱為O，O-二乙基-O-(3，5，6，-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，是一種廣譜殺蟲劑，具有胃毒、觸殺作用。據(jù)報道，毒死蜱已在世界100多個國家登記應(yīng)用［3］。但毒死蜱能明顯引起人和動物紅細(xì)胞膽堿酯酶的抑制［4］，蓄積于神經(jīng)系統(tǒng)后導(dǎo)致人出現(xiàn)惡心、頭暈，甚至神志不清等癥狀，高濃度暴露可造成呼吸麻痹和死亡［5］。因此國內(nèi)外越來越重視毒死蜱殘留問題及其影響:日本肯定列表制度中規(guī)定了毒死蜱在蔬菜中的最高殘留限量值為0.01 ～0.05 mg/kg，我國規(guī)定的無公害蔬菜中的最高殘留限量值為l mg/kg［6］。農(nóng)藥殘留的測定屬于痕量分析，樣品的處理方法至關(guān)重要。有關(guān)水果、蔬菜等作物中的毒死蜱殘留提取及檢測方法已有較多研究［7～12］，但川芎及其土壤中毒死蜱殘留提取方法的研究尚未見報道。本文建立了川芎植株和土壤中農(nóng)藥毒死蜱殘留檢測的最佳提取方法，為探討毒死蜱在川芎及土壤中的殘留動態(tài)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)，傘形科植物，由成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定。

川芎和土壤樣品采集于彭州市敖平鎮(zhèn)川芎GAP基地，未使用農(nóng)藥毒死蜱，作為空白樣品。

田間試驗(yàn)小區(qū)按推薦劑量100g/667m2噴施農(nóng)藥毒死蜱，2 d后采集川芎和土壤樣品，作為測定樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%，購于北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院;正十八烷，購自Accustandard Inc.;無水硫酸鈉、弗羅里硅土、乙腈、丙酮、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器與主要設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C)，配有DB-5MS 色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);TD6001型電子天平(天津天與儀器廠);HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(河南金博儀器制造有限公司);DCY-12G型氮吹儀(青島?？苾x器有限公司);KQ3200B型數(shù)控超聲波清洗器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司);層析柱(成都大法玻璃加工有限公司)，規(guī)格為20cm×1cm(內(nèi)徑)。

1.4 質(zhì)譜條件

進(jìn)樣口溫度為230℃，檢測器溫度為300℃;載氣為高純氮?dú)?純度99.999%)，流速15mL/min。升溫程序:初始溫度為100℃，保持 1min;以20℃/min升至 200℃，保持 1min;以 0.5℃/min升至201℃，保持1min;以10℃/min升至210℃，以20℃/min升至240℃，保持2min。進(jìn)樣方式為10∶1分流進(jìn)樣。進(jìn)樣體積:1 μL。電離方式EI，電離能量70 eV;離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍40～400 amu;選擇離子(SIM)時毒死蜱的特征離子質(zhì)量數(shù):197、258、314;正十八烷的特征離子質(zhì)量數(shù):57、71、254;溶劑延遲:6min。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.5.1 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制 精密稱取正十八烷4.16 mg置10mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.5.2 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品5.39 mg置25mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成0.215 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、5mL和 10mL 于100mL容量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液4.80mL，再準(zhǔn)確加入0.20mL的內(nèi)標(biāo)物溶液，混勻，配制成毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。

1.6 正交試驗(yàn)

為確定用于川芎地上部分、根莖及其栽培土壤中的毒死蜱殘留檢測的最佳提取方法，以提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量為四因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)(見表1、表2)。分別用毒死蜱處理空白川芎樣品和空白土壤樣品，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取方法分組提取后，GC-MS法檢測，分析毒死蜱回收率并得出最佳提取方法。

表1 川芎地上部分和根莖中毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design for chlorpyrifos residue extraction test in aerial parts and rhizome of Ligusticum chuanxiong.

表2 土壤中毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design for chlorpyrifos residue extraction test in soil.

1.7 正交試驗(yàn)樣品制備

1.7.1 川芎樣品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取10 g搗碎的空白川芎樣品的地上部分和根莖，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.01 mg/kg加入毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。靜置0.5 h后，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組進(jìn)行提取。將各組提取液用無水硫酸鈉去水后，減壓濃縮至近干。用5mL正己烷－乙酸乙酯(體積比1∶1)溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入20cm×1cm的Florisil柱(自制:從下至上分別為4 g弗羅里硅土、0.5 g活性炭)中后用40mL正己烷－乙酸乙酯(體1∶1)洗脫，收集流出液。收集的洗脫液經(jīng)減壓濃縮、氮吹至近干，用2mL丙酮溶解殘?jiān)^膜后用于GC-MS進(jìn)樣檢測。

1.7.2 土壤樣品溶液的制備 將采取的空白土壤樣品風(fēng)干，粉碎過1號篩。準(zhǔn)確稱取10 g后，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.01 mg/kg加入毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。靜置0.5 h后，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組進(jìn)行提取。將各組提取液減壓濃縮至近干后，用5mL丙酮溶解殘?jiān)抵两?，?mL丙酮溶解，過膜后用于GC-MS進(jìn)樣檢測。

1.8 最佳提取條件用于實(shí)際樣品的測定

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定川芎和土壤中毒死蜱殘留的最佳提取方法。按最佳提取方法提取1.2中的待測樣品。采用1.7中的濃縮凈化方法制備供試品溶液，按1.4中的GC-MS條件測定。

1.9 方法學(xué)驗(yàn)證

1.9.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取施藥處理2 d后的川芎和土壤樣品各6份，按正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件提取毒死蜱，制備供試樣品，GC-MS測定。

1.9.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取川芎和土壤樣品各 10 g，按低(0.1 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高(1 mg/kg)水平加入毒死蜱農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按最佳提取條件，制備供試樣品，GC-MS測定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量色譜圖如圖1所示。

以毒死蜱與正十八烷的峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，以毒死蜱與正十八烷的濃度之比為橫坐標(biāo)X進(jìn)行線性回歸分析。回歸方程為Y=2.409X－0.001 86，R2=0.999 3，結(jié)果顯示，在 0.215 6 ～21.56 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖1 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量色譜圖Fig.1 The EIC of chlorpyrifos.

圖2 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of chlorpyrifos.

2.2 川芎地上部分毒死蜱殘留提取方法的正交試驗(yàn)

川芎地上部分毒死蜱殘留提取與提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量有關(guān)。由表3、表4可知，各因素對毒死蜱回收率均有極顯著影響。雖然丙酮提取效果較乙腈好，但采用丙酮提取時，提取雜質(zhì)多，提取液中水分不易除去導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)耗時長，方差分析顯示兩者無顯著差異，故確定提取溶劑為乙腈。提取3次較提取2次的毒死蜱回收率高，但二者無顯著性差異，為簡化提取步驟，故確定提取次數(shù)為2次。最佳提取條件為A1B1C2D2，即:提取溶劑為乙腈、提取時間為15min、提取次數(shù)為2次、溶劑加入量為30mL。

表3 川芎地上部分毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in the aerial parts of Ligusticum chuanxiong.

表4 川芎地上部分毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in the aerial parts of Ligusticum chuanxiong.

2.3 川芎根莖毒死蜱殘留提取方法的正交試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量對川芎根莖中毒死蜱殘留提取的影響。表5、表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析顯示，除提取次數(shù)對毒死蜱回收率有顯著差異外，其余因素均有極顯著差異，且D(溶劑量)影響最大。多重比較后確定最佳提取條件同2.2。

2.4 川芎土壤中毒死蜱殘留提取方法的正交實(shí)驗(yàn)

川芎土壤中毒死蜱殘留提取效果與提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量有關(guān)。表7、表8結(jié)果說明，除提取溶劑對毒死蜱回收率有極顯著差異外，其余各因素均無顯著性差異，以提取時間的影響作用最小。最終確定最佳提取條件為E3F1G2H2，即:提取溶劑為乙酸乙酯、提取時間為30min、提取次數(shù)為 2次、溶劑加入量為100mL。

表5 川芎根莖毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in rhizome of Ligusticum chuanxiong.

表6 川芎根莖毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in rhizome of Ligusticum chuanxiong.

2.5 實(shí)際樣品測定效果

通過正交實(shí)驗(yàn)建立了川芎地上部分、根莖以及栽培土壤樣品中的毒死蜱的最佳提取方法，用于GC-MS法檢測毒死蜱殘留。該提取方法應(yīng)用于實(shí)際采集樣品的檢測的效果加以測試。GC-MS檢測結(jié)果如圖3、表9所示。

表7 土壤中毒死蜱殘留提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in soil.

表8 土壤中毒死蜱殘留正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal test result of the extraction of chlorpyrifos residue in soil.

表9 川芎植株和土壤中的毒死蜱殘留量Table 9 Residues of chlorpyrifos in Ligusticum chuanxiong plant and soil.

圖3 實(shí)際樣品中毒死蜱殘留的質(zhì)量色譜圖Fig.3 The EIC of chlorpyrifos extracted in actual samples.

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 重復(fù)性 川芎及土壤中毒死蜱殘留檢測提取方法的重復(fù)性結(jié)果見表10。川芎地上部分、根莖和土壤中毒死蜱的平均殘留量分別為10.73 mg/kg、7.40 mg/kg 和 1.18 mg/kg;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 分別為 4.08%、5.80% 和 3.45%(n=6)，符合實(shí)際農(nóng)藥殘留分析要求［13］。

表10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 10 Result of repeatability experiments.

2.6.2 加標(biāo)回收率 川芎及土壤中毒死蜱殘留檢測提取方法的回收率結(jié)果見表11。川芎地上部分毒死 蜱回收率分 別 為 99.48%、84.03% 和101.99%，RSD 分別為5.43%、3.65%和3.44%;根莖分別為88.25%、86.68%和 102.17%，RSD 分別為5.81%、0.68%和 2.03%;土壤分別為 72.86%、95.89%和104.01%，RSD 分別為4.97%、4.58%和4.69%(n=3)。結(jié)果符合農(nóng)藥殘留分析要求［13］。

表11 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 11 Recovery experiments.

2.7 毒死蜱殘留提取方法的確定

2.7.1 川芎地上部分及根莖中毒死蜱殘留檢測的提取方法 準(zhǔn)確稱取10 g搗碎的川芎樣品的地上部分和根莖于50mL錐形瓶中，加入30mL乙腈，超聲提取15min，提取2次。將提取液轉(zhuǎn)入裝有無水硫酸鈉的分液漏斗中，充分振蕩，靜置分層，棄去水層。有機(jī)相待濃縮后凈化。

2.7.2 土壤中毒死蜱殘留檢測的提取方法 準(zhǔn)確稱取風(fēng)干過篩后的土壤10 g于250mL錐形瓶中，加入100mL乙酸乙酯震蕩提取30min，重復(fù)上述過程一次。將提取液濾過至250mL圓底燒瓶后，減壓濃縮后過膜待檢測。

3 討論

川芎植株中的干擾物質(zhì)復(fù)雜多樣，合理的提取方法及凈化方法等前處理技術(shù)是準(zhǔn)確測定毒死蜱殘留量的重要前提。本實(shí)驗(yàn)前期，比較了超聲波提取法和振蕩提取法提取毒死蜱的效率。超聲波提取法耗時短，所需溶劑量小，且對川芎地上部分和根莖中毒死蜱的提取回收率分別為93.61%和89.20%，均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求。但采用超聲波提取土壤中的毒死蜱時，其回收率(77.03%)遠(yuǎn)低于振蕩法(86.72%)。因此，最終以超聲波提取法提取川芎植株中的毒死蜱，以振蕩法提取土壤中的毒死蜱。

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)川芎植株中提取雜質(zhì)較多，為滿足毒死蜱定量分析的需要，考察了丙酮∶正己烷(1∶9)、乙酸乙酯∶正己烷(1∶1)兩種淋洗劑的凈化回收率。比較結(jié)果發(fā)現(xiàn):40mL乙酸乙酯∶正己烷(1∶1)淋洗后，川芎地上部分和根莖中的毒死蜱凈化回收率均達(dá)到90%以上，表明該凈化方法切實(shí)可行。

在此基礎(chǔ)上，本文通過考察提取溶劑、提取時間、提取次數(shù)和溶劑量的不同水平下毒死蜱的回收率，篩選出川芎地上部分、根莖和土壤中毒死蜱殘留檢測的最佳提取條件，并建立了相應(yīng)的提取方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所確定的提取方法均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求，方法簡單實(shí)用，可用于中藥川芎中以及土壤中毒死蜱殘留的GC-MS檢測，以動態(tài)分析毒死蜱在川芎植株和土壤中的殘留情況。

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