于艷琴， 杜京旗， 趙 君， 楊衛(wèi)民

呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033001

目前，國(guó)內(nèi)外食品安全屢遭質(zhì)疑，人們對(duì)食用色素的使用也提出了更高的要求，相對(duì)于大多數(shù)具有致癌風(fēng)險(xiǎn)的人工合成色素，天然植物色素更受到人們的歡迎。天然色素將成為食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品不可缺少的重要添加劑［1］。研究表明，棗皮紅色素主要為類(lèi)黃酮類(lèi)［2～4］、橙酮類(lèi)物質(zhì)［5，6］、黃烷醇類(lèi)和黃酮醇類(lèi)物質(zhì)［7］。棗皮中除類(lèi)黃酮外，花青素和多酚類(lèi)等藥用成分含量也很可觀［8，9］，其他物質(zhì)還包括總酚酸和花色苷等［10］。趙文恩等［11］通過(guò) FRAP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，棗皮紅色素的總抗氧化能力與其黃酮類(lèi)物質(zhì)含量之間呈正相關(guān)性。棗皮紅色素還具有一定的抗還原能力，一定濃度食品添加劑對(duì)其影響不大［12］。因此，棗皮紅色素具有重要的實(shí)用價(jià)值［13］。

棗皮紅色素以色澤濃郁純正，水溶性好，具有消除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等多種藥用功效而著稱(chēng)。目前開(kāi)發(fā)和利用這一天然色素資源還存在許多問(wèn)題，前人也對(duì)其理化性質(zhì)做了一些初步的研究，但對(duì)其質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定和安全性分析還鮮有報(bào)道。本文以木棗皮為原料，經(jīng)酶解和微波超聲波處理后用一定濃度的NaOH溶液提取棗皮紅色素，對(duì)棗皮紅色素制品的理化指標(biāo)、質(zhì)量指標(biāo)及安全性進(jìn)行研究和分析，旨在為食品添加著色尋找一種優(yōu)質(zhì)的天然色素資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗皮由山西省木棗精華有限公司提供，木棗品種為山西柳林木棗。

實(shí)驗(yàn)試劑包括:NaOH、HCl、NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl2、CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O、Na2O2、K2HPO4·3H2O、無(wú)水乙醇、苯甲酸鈉、檸檬酸、苯甲酸、蔗糖、淀粉、抗壞血酸、葡萄糖、丙酮、苯、甲酸、冰乙酸、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、蛋白胨、乳糖、檸檬酸鐵銨、瓊脂粉、酸性復(fù)紅、去氧膽酸鈉、溴化麝香草酚藍(lán)、牛肉粉，均為分析純;纖維素酶、果膠酶均為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 主要儀器設(shè)備

XH-300B型祥鵠電腦微波超聲波組合合成萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司);ALB-224電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);THZ-82氣浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);Anke KA-1000離心機(jī);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);真空干燥箱D2F-3型(6020B)(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);VIS-723N可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);SPX-800B-G型光照培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LDZX-40Ⅱ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司);數(shù)位式照度計(jì)(北京清大時(shí)代科技有限公司)。

1.3 棗皮紅色素提取方法

棗皮經(jīng)粉碎后，采用混合酶液［1%纖維素酶∶1%果膠酶=1∶20(M/V)］酶解，50℃恒溫12 h，酶解后用微波超聲波組合萃取儀處理15min，分為3階段進(jìn)行，分別設(shè)置溫度50℃、60℃和70℃，超聲波功率800 W、900 W和1 000 W，微波功率200 W、250 W 和300 W，超聲波頻率25 KHz，模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速 900 r/min。處理后用 1%NaOH提取，所得處理液3 000 r/min離心去渣，5min/次，離心3次，合并濾液，用45微孔濾膜加100%乙醇反復(fù)減壓抽濾，直至無(wú)絮狀物出現(xiàn)，最后在真空干燥箱40℃干燥，得到棗皮紅色素制品。

1.4 棗皮紅色素的光譜特征與理化特性

1.4.1 光譜特征 將1 g棗皮紅色素制品用純水定容于100mL容量瓶中，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)在330～760 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定紅色素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.4.2 紅色素外觀的測(cè)定 將棗皮紅色素提取液經(jīng)過(guò)真空干燥法和冷凍干燥法濃縮后得到固體紅色素。觀察它的顏色、氣味、結(jié)晶狀況。

1.4.3 溶解度 取1 g的棗皮紅色素制品分別溶于5mL純水、甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、苯、甲酸、冰乙酸、乙酸乙酯、氯仿、石油醚，觀察溶解性及顏色變化。

1.4.4 紅色素色價(jià) 稱(chēng)取紅色素制品0.1 g，用pH 2.0的鹽酸乙醇溶液定容至200mL，以pH 2.0的鹽酸乙醇溶液作對(duì)照，測(cè)定其吸光值。根據(jù)公式計(jì)算色階。

式中，E為色價(jià);A為吸收值;f為稀釋度。

1.4.5 干重 稱(chēng)取紅色素制品0.5 g，于烘箱(105℃ ±2℃)中干燥2～4 h后稱(chēng)重，直至恒重，即為樣品干重。計(jì)算公式為:

式中，X:樣品的干燥失重(%);m1:干燥前帶有樣品的稱(chēng)量瓶和蓋的質(zhì)量(g);m2:干燥后帶有樣品的稱(chēng)量瓶和蓋的質(zhì)量(g);m0:干燥后空稱(chēng)量瓶和蓋的質(zhì)量(g)。

1.5 理化因子對(duì)棗皮紅色素性質(zhì)的影響

用純水將5 g紅色素制品定容于500mL容量瓶中，制成棗皮紅色素液，用于測(cè)定各種理化因子對(duì)棗皮紅色素的影響。

1.5.1 光照對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 取等份棗皮紅色素液10mL，在自然光照條件下分別放置0 h、3 h、6 h、9 h、12 h 和24 h，測(cè)定吸光值。

1.5.2 溫度對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 取等份棗皮紅色素液10mL分別置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的恒溫水浴中，3 h后至室溫時(shí)測(cè)定吸光值。

1.5.3 pH值對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 取等份棗皮紅色素液10mL，分別調(diào)節(jié)其pH為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 和13.0，測(cè)定吸光值。

1.5.4 金屬離子對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響取5支試管各加入5mL棗皮色素液，再分別加入濃度為 0.1 mol/L 的 KCl、MgCl2、ZnCl2溶液1mL，搖勻后室溫放置，定時(shí)取樣，測(cè)定吸光值。

1.5.5 甜味劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響在40mL棗皮紅色素液中分別加入0.2 g蔗糖、淀粉，使其濃度均為0.5%(M/V)，搖勻，每隔一定時(shí)間測(cè)定一次吸光值。

1.5.6 酸味劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響將0.04%和0.4%的檸檬酸鈉溶液分別加入到10mL棗皮紅色素液中，于室溫下暗處放置，每隔一定時(shí)間測(cè)定吸光值。

1.5.7 防腐劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響將0.04%和0.4%的苯甲酸鈉溶液分別加入到10mL棗皮紅色素液中，于室溫下暗處放置，每隔一定時(shí)間測(cè)定吸光值。

1.6 棗皮紅色素微生物含量的檢測(cè)

1.6.1 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 4789.2-2010)進(jìn)行食品微生物檢驗(yàn)，即測(cè)定菌落總數(shù)。取紅色素制品1 g，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)促|(zhì)量體積比(M/V)梯度稀釋為0%、1%、0.1%、0.01%的樣品溶液。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面分別滴加不同濃度紅色素制品0.2mL，涂布平板培養(yǎng)基表面。將接種好樣品的培養(yǎng)基放置于36±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48±2 h，并計(jì)數(shù)。

1.6.2 大腸菌群 MPN(coliforms most probable number)的測(cè)定 依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 4789.3-2010)中的方法進(jìn)行大腸菌群MPN的計(jì)數(shù)。取紅色素制品1 g，用無(wú)菌生理鹽水按質(zhì)量體積比(M/V)梯度稀釋為10%、1%、0.1%和0.01%的樣品溶液，各取1mL放入試管。將DC培養(yǎng)基溶化待冷卻至50℃左右，裝入上述試管，每管3mL，立即混勻。凝固后于36±1℃培養(yǎng)24 h并記錄。對(duì)產(chǎn)氣試管中的菌用伊紅美蘭培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，以排除假陽(yáng)性。

1.7 棗皮紅色素的應(yīng)用試驗(yàn)

1.7.1 在糖果中的應(yīng)用 稱(chēng)取10 g蔗糖，將其熔化然后立即加入20%的紅色素液5mL，將其攪拌混勻，冷卻即為一顆糖果。對(duì)著色效果進(jìn)行觀察。

1.7.2 在面食中的應(yīng)用 稱(chēng)取50 g豌豆面兩份，取5%紅色素液100mL與其混和，取100mL純水與其混和，制作成面條，煮熟前后對(duì)其顏色進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗皮紅色素的光譜特征與理化特性

棗皮紅色素提取液在330～760nm范圍內(nèi)掃描，由圖1可知，紅色素在340 nm附近有明顯的吸收波峰。因此，可將340 nm作為測(cè)定紅色素理化性質(zhì)的波段。

圖1 棗皮紅色素提取液的波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Wavelength scan of jujube fruit peel red pigment.

對(duì)提取的棗皮紅色素外觀進(jìn)行觀察，經(jīng)真空干燥后獲得的紅色素固體制劑為深棗紅色、有光澤、有一定的粘性，呈淡淡的棗香味。經(jīng)冷凍干燥獲得的紅色素固體制劑為棗紅色、有光澤，有濃濃的棗香味。

棗皮紅色素極易溶解于水和甲酸中，溶液均呈棗紅色;不溶于甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、苯、冰乙酸、乙酸乙酯、氯仿和石油醚，溶液均呈無(wú)色。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用冰乙酸溶解棗皮紅色素時(shí)溶液顏色呈無(wú)色、紅色素制品呈粉末狀，可以考慮使用冰乙酸來(lái)去雜，進(jìn)一步純化棗皮紅色素。

經(jīng)測(cè)定，紅色素的色價(jià)為6.52，含水量為20.12%。

2.2 各種理化因子對(duì)棗皮紅色素的性質(zhì)的影響

2.2.1 光照對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 無(wú)論處于光照下還是黑暗中，紅色素的吸光值都隨時(shí)間的變化出現(xiàn)相似的變化規(guī)律，即呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì);光照條件下其吸光值下降較避光條件下要快(圖2)。因此，應(yīng)該盡量避光保存棗皮紅色素。

圖2 光照時(shí)間對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.2 Effects of illumination time on jujube fruit peel red pigment.

2.2.2 溫度對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 在0℃～60℃范圍內(nèi)，紅色素吸光值保持不變;60℃ ～100℃范圍內(nèi)，紅色素的吸光值有所下降(圖3)。說(shuō)明紅色素具有較好的耐熱性。

圖3 溫度對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.3 Effects of temperature on jujube fruit peel red pigment.

2.2.3 pH值對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響 酸堿性對(duì)紅色素吸光值影響很顯著，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)pH＜3.0時(shí)，紅色素吸光值比較低，溶液為橙紅色;pH＞7.0時(shí)，棗皮紅色素呈一定穩(wěn)定狀態(tài)，且溶液為棗紅色;pH約為5.0時(shí)，棗皮紅色素出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾后，上清液為橙紅色。沉淀用純水洗下來(lái)，不完全溶解，加入1.0 mol/L NaOH全部溶解，并成為棗紅色溶液。

2.2.4 金屬離子對(duì)紅色素理化性質(zhì)的影響K+、Mg2+、Zn2+對(duì)紅色素的理化性質(zhì)影響較小，在368 nm下的吸光值呈現(xiàn)先緩慢下降后保持穩(wěn)定的狀態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 pH值對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.4 Effects of pH on jujube fruit peel red pigment.

圖5 金屬離子對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.5 Effects of metal ion on jujube fruit peel red pigment.

2.2.5 甜味劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響甜味劑主要考察蔗糖和淀粉對(duì)棗皮紅色素的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。蔗糖對(duì)棗皮紅色素的的理化性質(zhì)影響較小;淀粉則影響較明顯，紅色素在368 nm處吸光值明顯下降，隨時(shí)間推移，下降更明顯。

2.2.6 酸味劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響檸檬酸對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)有一定的影響(圖7)，高濃度檸檬酸(0.4%)的影響比低濃度檸檬酸(0.04%)的影響稍大，均降低紅色素的吸光值。

2.2.7 防腐劑對(duì)棗皮紅色素理化性質(zhì)的影響苯甲酸鈉是常見(jiàn)食品添加劑，0.04%、0.4%的苯甲酸鈉對(duì)紅色素理化性質(zhì)有一定影響，但影響不大(圖8)。

圖6 不同甜味劑對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.6 Effects of different sweeteners on jujube fruit peel red pigment.

圖7 不同濃度檸檬酸對(duì)棗皮紅色素的影響Fig.7 Effects of different concentrations of citric acid on jujube fruit peel red pigment.

圖8 不同濃度苯甲酸鈉對(duì)紅色素的影響Fig.8 Effects of different concentrations of sodium benzoate on jujube fruit peel red pigment.

2.3 棗皮紅色素制品的微生物檢測(cè)

2.3.1 細(xì)菌總數(shù) 依《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 4789.2—2010)測(cè)定紅色素制品在平板上菌落數(shù)，幾個(gè)稀釋度經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后均未有菌落產(chǎn)生，經(jīng)計(jì)算紅色素的菌落總數(shù)0.8×1×10－4=8×10－5CFU/mL。

2.3.2 大腸菌群MPN 對(duì)不同稀釋度紅色素溶液在DC培養(yǎng)基中革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)的情況進(jìn)行觀察。經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，其中一個(gè)試管有產(chǎn)氣現(xiàn)象，依《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 4789.3—2010)，用伊紅美蘭培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氣試管中的菌進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，伊紅美蘭培養(yǎng)基中未形成紫黑色菌落，所以確定產(chǎn)氣管為假陽(yáng)性。因此，被檢測(cè)的紅色素各稀釋度下都為陰性。由大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表得大腸菌群MPN＜3.0。

2.4 棗皮紅色素制品食品添加的應(yīng)用效果

紅色素加入蔗糖后有棗香味，顏色呈橙紅色，加熱后其橙紅色基本保持不變。紅色素可作為糖果等食品的食用色素添加劑使用。

在豌豆面中添加棗皮紅色素，著色效果如圖9(彩圖見(jiàn)封三圖版)，煮后與煮前對(duì)比，煮后比煮前顏色更鮮紅，含水量增多。

圖9 添加棗皮紅色素制作成的豌豆面條Fig.9 Peas pasta adding jujube fruit peel red pigment.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制得的棗皮紅色素制品呈棗紅色顆粒狀，其水溶液呈深棗紅色，具有典型的棗香味，色澤濃郁純正，保持了木棗原有的風(fēng)味特色。棗皮紅色素制品不溶于甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、苯、冰乙酸、乙酸乙酯、氯仿和石油醚，但在紅色素提取中棗皮原料不可避免地混雜有鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)和淀粉等雜質(zhì)，利用其不溶于乙醇的特性在紅色素純化中剔除鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)和淀粉等雜質(zhì)，安全環(huán)保;利用冰乙酸溶解棗皮紅色素制品時(shí)溶液顏色呈無(wú)色，且紅色素制品呈粉末狀的特點(diǎn)，可以使用冰乙酸來(lái)去雜，進(jìn)一步純化紅色素。此方法應(yīng)用于從棗泥和棗核中提取紅色素應(yīng)該更有效。

紅色素制品對(duì)溫度、部分金屬離子(K+、Mg2+、Zn2+)具有較好的穩(wěn)定性;光照對(duì)其理化性質(zhì)有一定的影響，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì);對(duì)酸堿性十分敏感，在pH 1.0～7.0范圍內(nèi)不穩(wěn)定，pH 7.0～14.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。大部分天然色素分子對(duì)金屬離子反應(yīng)敏感，但紅色素制品對(duì)K+、Mg2+、Zn2+具有較好的穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)充分考慮紅色素制品光氧化反應(yīng)和對(duì)酸性條件的敏感度，這樣有利于保持紅色素制品的品質(zhì)。

紅色素制品對(duì)蔗糖、苯甲酸鈉、檸檬酸具有較好的穩(wěn)定性;其色價(jià)為6.52，含水量為20.12%;微生物檢測(cè)結(jié)果表明;其菌落總數(shù)為8×10－5CFU/mL，細(xì)菌污染的可能性很低;大腸菌群MPN值＜3，顯色呈陰性，無(wú)大腸桿菌。由于其著色力較弱，實(shí)際使用中會(huì)造成成本的提高;含水量高的原因可能是色素制品中還含有其他雜質(zhì)，也可能是由于其分子結(jié)構(gòu)中有過(guò)多的羥基造成的，研究中也發(fā)現(xiàn)如果將紅色素制品在室內(nèi)自然保存，其含水量有明顯的增加。因此，在實(shí)際應(yīng)用中一定要采取適當(dāng)?shù)拇胧苊庾匀晃鼭裨斐傻馁|(zhì)變。

棗皮紅色素是水溶性極好的色素，具有較好的理化性質(zhì);質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定和安全性分析結(jié)果良好;資源豐富、來(lái)源廣泛且色澤亮麗，提取工藝簡(jiǎn)單，且具有消除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等多種藥用功效，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的食用色素。

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