姚秀萍，陳思希，任亞光，周懷彬，呂建新

（溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

細(xì)胞在內(nèi)部或外界環(huán)境的不利刺激下引起蛋白穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)會(huì)激活一系列的保護(hù)性反應(yīng)，具體到細(xì)胞內(nèi)的不同部位有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)未折疊蛋白反應(yīng)、線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mtochondrial unfolded protein response，UPRmt）[1-6]。當(dāng)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)受到影響時(shí)，細(xì)胞核基因編碼的定位于線粒體的分子伴侶HSP-6、HSP-60等的表達(dá)會(huì)上調(diào)，以使發(fā)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)形成正確構(gòu)象并促進(jìn)新生蛋白質(zhì)的正確折疊，這一過(guò)程叫作UPRmt[7-9]。轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1介導(dǎo)UPRmt信號(hào)通路，ATFS-1含有線粒體及細(xì)胞核定位序列，在正常條件下，ATFS-1進(jìn)入線粒體并被蛋白酶CLPP-1、LON-1等降解；在線粒體受到應(yīng)激時(shí)，如線粒體亞基被RNAi敲低等，ATFS-1進(jìn)入線粒體減少而進(jìn)入細(xì)胞核增多，從而激活下游基因如分子伴侶HSP-6、HSP-60等表達(dá)，即激活UPRmt[10-11]。線粒體膜蛋白HAF-1被認(rèn)為介導(dǎo)線粒體與細(xì)胞核之間的信號(hào)傳遞并參與UPRmt，然而最近發(fā)現(xiàn)clk-1的敲低通過(guò)HAF-1激活UPRmt，而nuo-6、cco-1等基因RNAi對(duì)UPRmt的激活則不依賴HAF-1[10，12-14]。

線粒體功能紊亂與人類許多疾病的發(fā)生有關(guān)，然而在線蟲(chóng)及果蠅等低等生物中卻延緩衰老[15-17]。我們此前發(fā)現(xiàn)，敲低線蟲(chóng)線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白MFN-1后顯著延長(zhǎng)壽命[18]?，F(xiàn)就mfn-1RNAi是否激活UPRmt及其激活的信號(hào)通路進(jìn)行研究，今后將進(jìn)一步驗(yàn)證UPRmt的激活是否介導(dǎo)了mfn-1RNAi壽命延長(zhǎng)。

1 材料和方法

1.1 材料 線蟲(chóng)N2、SJ4058、SJ4100、TJ375、SJ4005、RB867、VC3201，大腸桿菌HT115（DE3）由Caenorhabditis genetics center（CGC）提供；質(zhì)粒L4440由本實(shí)驗(yàn)室保存；LA Taq酶、DNA marker購(gòu)自寶生物有限公司；異丙基硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素、鹽酸四環(huán)素鈉、瓊脂、蛋白胨、酵母提取液、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等試劑購(gòu)自Sigma；其他材料為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 SJ4058雄蟲(chóng)的制備 將L4期SJ4058線蟲(chóng)挑至鋪有HT115菌膜的板上，每板6條，共5個(gè)板，置于31 ℃熱激6 h，然后置于20 ℃培養(yǎng)。3～4 d后尋找F1代雄性線蟲(chóng)（尾巴有突起狀），將其挑至新的HT115菌膜上，然后再挑入3條雌雄同體線蟲(chóng)雜交，F(xiàn)2代可獲得大量SJ4058雄蟲(chóng)。

1.3 SJ4058線蟲(chóng)與VC3201線蟲(chóng)的雜交 將SJ4058線蟲(chóng)雄蟲(chóng)20條與VC3201線蟲(chóng)雌雄同體2條挑至同一個(gè)鋪有HT115菌膜的NGM板上（3.5 cm直徑小平皿）讓其交配產(chǎn)生F1代，將F1代雌雄同體線蟲(chóng)2條轉(zhuǎn)到新的含菌膜NGM板上讓其產(chǎn)生F2代，挑取50條F2代分別于50個(gè)NGM平板上，每板1條并編號(hào)，待其產(chǎn)卵后，PCR鑒定F2代基因型，篩選出含atfs-1純合子及hsp-60::gfp線蟲(chóng)（雜合或者純合），保留陽(yáng)性的F2代平板，將每個(gè)陽(yáng)性板上的F3線蟲(chóng)取20條通過(guò)PCR鑒定hsp-60::gfp，若某個(gè)板上20條F3全能擴(kuò)增出目的基因，則該板很可能為純合子hsp-60::gfp，最后將篩選到的陽(yáng)性線蟲(chóng)品系傳一兩代后進(jìn)一步PCR驗(yàn)證以確認(rèn)。所有PCR鑒定過(guò)程均以野生型N2線蟲(chóng)為陰性對(duì)照，不加模板的為空白對(duì)照。鑒定hsp-60::gfp所用引物為：hsp-60::gfp上游（5’-CATTTTACCGCCTGA AATTC-3’），hsp-60::gfp下游（5’-CTTCCATCTTCAATGT TGTG-3’），鑒定atfs-1所用引物為：atfs-1上游（5’-TTTCAGTCGTTTCAGGACCC-3’），atfs-1下游（5’-TCATCGA GTTGATCTCACGC-3’）。PCR反應(yīng)條件為：dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）1.6 L，10×PCR buffer 1 L，上游引物0.2 L，下游引物0.2 L，LA Taq酶（5 U/ L）0.1 L，ddH2O 6.9 L，模板DNA 5 L，總體積為15 L。反應(yīng)條件：①94 ℃ 4 min；②94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共39個(gè)循環(huán)；③72 ℃20 min；④保持在4 ℃。取5 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 SJ4058線蟲(chóng)與RB867線蟲(chóng)雜交 方法類似，鑒定hsp-60::gfp用引物同上。鑒定haf-1引物為：haf-1上游（5’-CACCCCTGTCACAGACCTTT-3’），haf-1下游（5’-CGCCAGAGAACAACAGATGA-3’）。PCR反應(yīng)條件為：dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）1.6 L，10×PCR buffer 1 L，上游引物0.2 L，下游引物0.2 L，LA Taq酶（5 U/ L）0.1 L，ddH2O 6.9 L，模板DNA 5 L，總體積為15 L。反應(yīng)條件：①94 ℃ 4 min；②94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共39個(gè)循環(huán)；③72 ℃ 20 min；④保持在4 ℃。取5 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 秀麗線蟲(chóng)mfn-1的RNA干擾 分別挑取含mfn-1干擾質(zhì)粒及空載l4440質(zhì)粒的HT115菌在3 mL液體LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素終濃度100 g/mL，四環(huán)素12.5 g/mL）中培養(yǎng)約10 h，再加入3 L 1 mol/L IPTG培養(yǎng)1 h，然后各取70 L菌液均勻涂于NGM平板（含氨芐青霉素終濃度100 g/mL，四環(huán)素12.5 g/mL，IPTG 238.3 g/mL），放于25 ℃誘導(dǎo)12～16 h。然后將L4期線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至菌膜上，3～4 d后，取F1代進(jìn)行各種指標(biāo)觀測(cè)。

1.6 倒置熒光顯微鏡觀測(cè) 配3%的瓊脂糖，加熱融化后滴1滴于載玻片，立即加上蓋玻片，使瓊脂糖形成硬幣大小的膜，然后移走蓋玻片。在瓊脂糖膜上滴1滴0.5%的左旋霉素麻醉劑，將同步化的mfn-1RNAi及空載l4440 RNAi處理F1代成蟲(chóng)分別放到麻醉劑里，1 min后即可觀測(cè)熒光。在同樣的曝光條件及放大倍數(shù)下觀測(cè)熒光并拍照。

2 結(jié)果

2.1 將SJ4058線蟲(chóng)分別與VC3201及RB867線蟲(chóng)雜交后獲得基因型分別為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V及hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV的線蟲(chóng) 首先通過(guò)熱激獲得了SJ4058雄性線蟲(chóng)，將雄性SJ4058線蟲(chóng)分別與雌雄同體VC3201及RB867線蟲(chóng)雜交，通過(guò)前述方法雜交并PCR鑒定篩選到基因型為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V和hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV的線蟲(chóng)，將該兩品系線蟲(chóng)傳幾代后進(jìn)一步PCR確認(rèn)其基因型，成功獲得雜交的線蟲(chóng)，如圖1-2所示。

圖1 PCR鑒定基因型為hsp-60::gfp/atfs-1(gk3094)V的雜交線蟲(chóng)

圖2 PCR鑒定基因型為hsp-60::gfp/haf-1(ok705)IV的線蟲(chóng)

2.2Mfn-1RNAi特異性激活UPRmt分別將線蟲(chóng)SJ4058、SJ4100、TJ375、SJ4005的L4期幼蟲(chóng)放在含mfn-1RNAi質(zhì)粒及l(fā)4440空載的HT115菌膜上進(jìn)行干擾，方法如前所述。然后將F2代線蟲(chóng)在熒光倒置顯微鏡下觀測(cè)綠色熒光，根據(jù)觀測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mfn-1RNAi激活了線粒體的分子伴侶HSP-6及HSP-60的表達(dá)，而并沒(méi)激活細(xì)胞質(zhì)分子伴侶HSP-16.2及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶HSP-4的表達(dá)，如圖3所示。這表明mfn-1RNAi可能影響了線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，激活了線粒體的反饋性反應(yīng)，而細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)未受到明顯影響。

2.3Mfn-1RNAi對(duì)UPRmt的激活不依賴于線粒體膜蛋白HAF-1，而依賴于轉(zhuǎn)錄因子ATFS-1 為了驗(yàn)證mfn-1RNAi通過(guò)什么通路激活UPRmt，我們構(gòu)建了基因型分別為hsp-60::gfp/atfs-1（gk3094）V及hsp-60::gfp/haf-1（ok705）IV線蟲(chóng)，對(duì)該兩種線蟲(chóng)進(jìn)行mfn-1RNAi處理后觀測(cè)熒光，并以L4440空載為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在atfs-1基因功能缺失線蟲(chóng)中，HSP-60表達(dá)不能被激活，而haf-1基因功能缺失的線蟲(chóng)中，HSP-60的表達(dá)仍然可以激活，如圖4所示。這說(shuō)明mfn-1RNAi 對(duì)UPRmt的激活依賴于ATFS-1，而不依賴于HAF-1。

圖3 Mfn-1 RNAi特異性激活線粒體分子伴侶，而未激活細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的表達(dá)（×100，200 ms）

圖4 Mfn-1 RNAi對(duì)HSP-60表達(dá)的激活依賴于ATFS-1，而不依賴于HAF-1（×100，200 ms）

3 討論

線粒體是ATP合成、三羧酸循環(huán)、鐵硫簇及血紅素合成的主要場(chǎng)所[19-21]。線粒體功能紊亂與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如線粒體儲(chǔ)鐵蛋白frataxin突變引起弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，鐵硫簇組裝支架蛋白iscu突變引起肌?。╩yopathy）等[22]。在線蟲(chóng)中卻發(fā)現(xiàn)許多呼吸鏈亞基突變可以延長(zhǎng)壽命，某些保護(hù)性機(jī)制的激活被認(rèn)為促進(jìn)了長(zhǎng)壽，主要有自噬、UPRmt、蛋白質(zhì)翻譯速率降低等[17，23]。深入研究這些機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)線粒體疾病的新治療方法。

MFN-1是線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白，我們?cè)诖饲暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi后引起線蟲(chóng)體型變小，繁殖力下降，然而壽命卻顯著延長(zhǎng)[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi激活了UPRmt，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的未折疊蛋白反應(yīng)則沒(méi)有激活。這提示mfn-1RNAi影響了線粒體功能或蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞質(zhì)蛋白穩(wěn)態(tài)影響不大。我們將hsp-60::gfp轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)SJ4058與atfs-1基因功能缺失線蟲(chóng)VC3201雜交，發(fā)現(xiàn)當(dāng)atfs-1缺失時(shí)，UPRmt不能再被激活。這說(shuō)明mfn-1RNAi對(duì)UPRmt的激活依賴于ATFS-1。采用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)mfn-1RNAi對(duì)UPRmt的激活不依賴于線粒體膜蛋白HAF-1。這也與文獻(xiàn)報(bào)道一致，如ISP-1、NUO-6等大部分定位于線粒體的蛋白表達(dá)降低對(duì)UPRmt的激活也不依賴于HAF-1[10，13，24]。本研究有助于繼續(xù)探索UPRmt的激活是否與mfn-1RNAi延長(zhǎng)壽命有關(guān)。

[1]Chakrabarti A, Chen AW, Varner JD. A review of the mammalian unfolded protein response[J]. Biotechnol Bioeng,2011, 108(12): 2777-2793.

[2]Oslowski CM, Urano F. The binary switch that controls the life and death decisions of ER stressed beta cells[J]. Curr Opin Cell Biol, 2011, 23(2): 207-215.

[3]Hu F, Liu F. Mitochondrial stress: a bridge between mitochondrial dysfunction and metabolic diseases?[J]Cell Signal, 2011, 23(10): 1528-1533.

[4]Whelan SP, Zuckerbraun BS. Mitochondrial signaling: forwards, backwards, and in between[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013: 351613.

[5]Gidalevitz T, Prahlad V, Morimoto RI. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms[J].Cold Spring Harb Perspect Biol, 2011, 3(6): a009704.

[6]Calderwood SK, Murshid A, Prince T. The shock of aging:molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging-a mini-review[J]. Gerontology, 2009, 55(5): 550-558.

[7]Pellegrino MW, Nargund AM, Haynes CM. Signaling the mitochondrial unfolded protein response[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1833(2): 410-416.

[8]Haynes1 CM, Ron D. The mitochondrial UPR-protecting organelle protein homeostasis[J]. J Cell Sci, 2010, 123(pt 22):3849-3855.

[9]Jovaisaite V, Mouchiroud L,Auwerx J. The mitochondrial unfolded protein response, a conserved stress response pathway with implications in health and disease[J]. J Exp Biol, 2014, 217(pt 11): 137-143

[10]Nargund AM, Pellegrino MW, Fiorese CJ, et al. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation[J]. Science, 2012, 337(6094): 587-590.

[11]Tatsuta T, Langer T. Quality control of mitochondria: protection against neurodegeneration and ageing[J]. Embo J,2008, 27(2): 306-314.

[12]Haynes CM, Yang Y, Blais SP, et al. The matrix peptide exporter HAF-1 signals a mitochondrial UPR by activating the transcription factor ZC376.7 in C. elegans[J]. Mol Cell,2010, 37(4): 529-540.

[13]Pujol C, Bratic-Hench I, Sumakovic M, et al. Succinate dehydrogenase upregulation destabilize complex I and limits the lifespan of gas-1 mutant[J]. PLoS One, 2013, 8(3):e59493.

[14]Lee SJ, Hwang AB, Kenyon C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity[J]. Curr Biol, 2010, 20(23): 2131-2136.

[15]Wallace DC. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine[J]. Annu Rev Genet, 2005, 39: 359-407

[16]Copeland JM, Cho J, Lo T Jr, et al. Extension of Drosophila life span by RNAi of the mitochondrial respiratory chain[J]. Curr Biol, 2009, 19(19): 1591-1598.

[17]Lee SS, Lee RY, Fraser AG, et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity[J]. Nat Genet, 2003, 33(1): 40-48.

[18]Ren Y, Yang S, Tan G, et al. Reduction of mitoferrin results in abnormal development and extended lifespan in Caenorhabditis elegans[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29666.

[19]Phielix E, Szendroedi J, Roden M. Mitochondrial function and insulin resistance during aging: a mini-review[J]. Gerontology, 2011, 57(5): 387-396.

[20]Schultz IJ, Chen C, Paw BH, et al. Iron and porphyrin traffi cking in heme biogenesis[J]. J Biol Chem, 2010, 285(35):26753-26759.

[21]Rawat S, Stemmler TL. Key players and their role during mitochondrial iron-sulfur cluster biosynthesis[J]. Chemistry,2011, 17(3): 746-753.

[22]Lu C, Cortopassi G. Frataxin knockdown causes loss of cytoplasmic iron-sulfur cluster functions, redox alterations and induction of heme transcripts[J]. Arch Biochem Biophys,2007, 457(1): 111-122.

[23]Durieux J, Wolff S, Dillin A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity[J]. Cell,2011, 144(1): 79-91.

[24]Runkel ED, Liu S, Baumeister R, et al. Surveillance-activated defenses block the ROS-induced mitochondrial unfolded protein response[J]. PLoS Genet, 2013, 9(3): e1003346.