萬 丹，張水寒*，蔡 萍，肖 娟，佘高照

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410008；2.楊永華全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，湖南 長沙 410008；3.湖南龍山縣現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限責(zé)任公司，湖南 龍山 416800）

Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選雙百安神膠囊提取工藝

萬 丹1，2，張水寒1，2*，蔡 萍1，2，肖 娟1，2，佘高照3

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410008；2.楊永華全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室，湖南 長沙 410008；3.湖南龍山縣現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限責(zé)任公司，湖南 龍山 416800）

目的 對雙百安神膠囊提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法 以酸棗仁總皂苷、干膏得率為評價指標(biāo)，以加醇量、乙醇濃度、提取時間為考察因素，采用Box-Behnken-效應(yīng)曲面法，優(yōu)選雙百安神膠囊提取工藝參數(shù)。結(jié)果 通過Box-Behnken設(shè)計效應(yīng)面法所得模型優(yōu)化提取條件為：第1次加7倍量60%乙醇，提取2 h；第2次加6倍量60%乙醇，提取1.5 h。結(jié)論 采用效應(yīng)面法優(yōu)選的雙百安神膠囊提取工藝合理可行。

雙百安神膠囊；Box-Behnken設(shè)計；提取工藝

雙百安神膠囊系由湖南省中醫(yī)藥研究院與湖南龍山縣現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限責(zé)任公司合作研發(fā)的一種新型的保健藥品，主要由百合、百合花、酸棗仁等藥味組成，用于改善睡眠、調(diào)節(jié)情志、治療大腦神經(jīng)功能紊亂引起的失眠多夢、憂郁煩躁、幻聽恐懼等癥，具有養(yǎng)心安神，疏肝瀉火的功效。本文采用Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法，以酸棗仁總皂苷、干膏得率為評價指標(biāo)，優(yōu)選雙百安神膠囊的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計UV-2450(日本島津)。

1.2 試藥

購自湖南省藥材公司飲片廠及湖南龍山縣現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限責(zé)任公司；酸棗仁皂苷A對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110734-200509，供含量測定用），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 干膏得率的測定[1]

精密吸取提取液樣品適量，至已恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄干燥失重法測定，計算干膏得率。

2.2 酸棗仁總皂苷含量的測定[2-4]

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取酸棗仁皂苷A對照品5.5 mg，加甲醇制成0.55 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取酸棗仁皂苷A對照液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于具塞試管內(nèi)，揮干溶劑，再分別加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，混勻、密塞，置60℃恒溫水浴中顯色15 min，取出后立即以冰水冷卻5 min，各加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min，以試劑空白為參比，于波長546 nm處測其吸光度。以酸棗仁皂苷A質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），吸光度A為縱坐標(biāo)（Y），繪制酸棗仁皂苷A標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明:酸棗仁皂苷A對照品在0.11～1.1 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得線性方程:

2.2.3 供試品溶液的制備和測定 精密量取已定容的提取液50 mL，水浴蒸干，取適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶解，吸取百合等提取液各1.0 mL，置于具塞試管內(nèi)。按“2.2.2”項下方法，測定其吸光度。

3 工藝研究

3.1 提取次數(shù)考查

按處方的1/100量稱取藥材，約175 g，加入60%乙醇提取3次，依次加藥材8、7、6倍量乙醇提取2.0 h，濾過，分別收集濾液濃縮并定容至50 mL，依據(jù)測定干膏得率、酸棗仁總皂苷提取量，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明:第3次提取的干膏得率、酸棗仁總皂苷提取量分別占3次總提取數(shù)的8.8%、2.2%，考慮到生產(chǎn)成本與效率問題，應(yīng)以提取2次為宜。

表1 提取次數(shù)考查結(jié)果

3.2 Box-Behnken-試驗設(shè)計

在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，確定影響雙百安神膠囊提取工藝的因素主要有加醇倍數(shù)、乙醇濃度、提取時間及提取次數(shù)。但因提取次數(shù)為非連續(xù)變量[5]，在模型擬合中處理較困難，結(jié)合單因素考察實驗結(jié)果，確定提取次數(shù)為2次。根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，本實驗選取加醇倍數(shù) （A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）三因素為自變量，以干膏得率（Y1）、酸棗仁總皂苷提取量（Y2）兩個指標(biāo)為效應(yīng)值，采用3因素3水平的效應(yīng)面分析方法進(jìn)行分析，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計及響應(yīng)結(jié)果

3.3 結(jié)果

3.3.1 多元二次效應(yīng)面回歸模型的建立與分析 采用Minitab 16.0軟件對表2建立多元二次效應(yīng)面回歸模型，得擬合方程Y1=-116.88+4.954A+2.795B+ 12.04C+0.02300AB-0.2038AC-0.06400BC-0.1949A2-0.02528B2-0.7746C2，Y2=-212.05+4.726A+6.401B+ 19.37C+0.09775AB-0.2262AC-0.08400BC-0.3121A2-0.06342B2-1.5158C2。結(jié)果見表3。

表3 二項式回歸模型方差分析結(jié)果

由方差分析可知，對于Y1和Y2這2個指標(biāo)，模型方程Y1的P值為0.014（P<0.05），Y2的P值為0.005（P<0.01），表明實驗所采用的二次模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項 P值分別為 0.059、0.090，均> 0.05，無明顯失擬因素存在，可充分反映實際情況。針對上述方程各項系數(shù)的顯著性進(jìn)行的統(tǒng)計檢驗，結(jié)果Y1模型方程中A項的P值為0.003<0.01，B、C、A2、B2、C2項的P值<0.05，說明這幾項具有顯著性影響，剩余項均>0.05，說明無顯著性影響。Y2模型方程中A、B項的P值分別為0.001、0.002<0.01，C、B2、C2項的P值<0.05，說明這幾項具有顯著性影響，剩余項均P>0.05，說明無顯著性影響。

3.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 根據(jù)優(yōu)化后的二項式方程，運用Minitab軟件作三維效應(yīng)面圖（見圖1）。根據(jù)二項回歸方程，計算出優(yōu)化條件:A=13.38，B= 60%，C=3.5 h， 可預(yù)測出 Y1為 19.5%，Y2為49.9 mg。Y1合意性為0.97，Y1合意性為0.99，復(fù)合合意性為0.98?？紤]到實驗操作的科學(xué)性，最優(yōu)工藝設(shè)計為加醇倍數(shù)為13倍，乙醇濃度為60%，提取時間為3.5 h。

圖1 各因素與響應(yīng)值的三維圖

3.3.3 驗證試驗 按處方的1/100量稱取藥材3份，據(jù)最佳工藝條件提取樣品，測定Y1和Y2。Y1結(jié)果分別為19.49%、19.18%、19.61%，平均干膏得率為19.4%。Y2分別為48.85、49.38、49.74 mg，平均含量為49.3 mg。驗證試驗結(jié)果與與理論值比較，Y1和Y2相對偏差分別為0.4%、1.1%，表明優(yōu)選工藝提取效果較為理想。

4 討論

酸棗仁中皂苷類成分為鎮(zhèn)靜、催眠的主要藥效成分，對睡眠的改善有很好的效果。且藥理研究表明酸棗仁總皂苷能減少小鼠自發(fā)活動，協(xié)同苯丙胺的中樞興奮作用，其中樞抑制作用也呈劑量依賴性[6]，所以本實驗以酸棗仁總皂苷為指標(biāo)成分，對雙百安神膠囊提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。

本試驗采用適合于非線性擬合Box-Behnken-效應(yīng)面法優(yōu)選百安神膠囊最佳提取工藝，得出加醇倍數(shù)、乙醇濃度、提取時間對酸棗仁總皂苷提取率和干膏得率的效應(yīng)趨勢，從實驗結(jié)果可知，加醇倍數(shù)、乙醇濃度、提取時間對提取工藝有顯著影響，但各因素之間并無交互作用。試驗優(yōu)選的提取工藝，能降低能耗、節(jié)約原料，且可提高雙百安神膠囊有效成分提取率，為成功研發(fā)出雙百安神膠囊提供實驗依據(jù)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄Ⅸ G.

[2]王筱亮，張玉杰，陳明霞，等.多指標(biāo)正交試驗優(yōu)選酸棗仁最佳提取工藝[J].中國中藥雜志，2005，30(10):753-755.

[3]高聲傳，郭 濤，夏維杰，等.比色法測定酸棗仁提取物中總皂苷的含量[J].實用藥物與臨床，2005，8(1):15-16.

[4]程小麗，張 偉.酸棗仁總皂苷的提取分離及含量測定[J].陜西中醫(yī)，2012，33(5):607-609.

[5]顧媛媛，王建明，宋成貴，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選鳳仙透骨草的提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（4）:59-61.

[6]鄭 曄，錢蘇瑜，游自立.酸棗仁藥理作用研究進(jìn)展[J].四川生理科學(xué)雜志，2006，28（1）:35-37.

（本文編輯 楊 瑛）

Optimization of extracting technology for Shuangbai Anshen Capsule by Box-Behnken design and response surface method

WAN Dan1,ZHANG Shuihan1*,CAI Ping1*,XIAO Juan1,2,SHE Gaozhao3
(1.Research Institute of Chinese Medicine,Hunan Academy of CM,Changsha,Hunan 410008, China;2.The Inheritance Studio of Yang Yong-hua,the Famous TCM eχperts,Changsha,Hunan 410008,China;3.Modern Traditional Chinese Medicine Development co.,LTD,Longshan County, Hunan Province,Longshan,Hunan 416800,China)

Objective To optimize the extracting technology of Shuangbai Anshen Capsule. Methods The total saponins of semen ziziphi spinosae(szs)and extract yield used as indices,the extracting technology of Shuangbai Anshen Capsule was optimized by Box-Behnken design and response surface method from the aspects of ethanol amount,ethanol concentration,and extracting time.Results The preferred processing conditions were as follows:add 7 times of 60%alcohol, extracted for 2 h,and then add 6 times of 60%alcohol,extracted for 1.5 h.Conclusion The extracting technology optimized by Box-Behnken design and response surface method is reasonable and feasible.

Shuangbai Anshen Capsule;Box-Behnken design;extracting technology

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.006.022.03

2013－09－30

湖南省科技廳重點項目(2013NK2008)；“十二五”國家科技支撐計劃子課題(2011BAD10B01)。

萬 丹，女，實習(xí)研究員，研究方向:中藥新制劑與新技術(shù)。

*張水寒，女，研究員，E-mail:zhangshuihan0220@126.com。