陳峻峰，顏智勇，邵繼海，舒 鵬，王 杰，文樹龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

畜禽養(yǎng)殖廢水是一種具有高COD、高氨氮、高SS且難處理的廢水［1，2］。四環(huán)素類抗生素是規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)常用的抗生素之一，具有較強(qiáng)的抗菌效應(yīng)。金霉素是一種典型的四環(huán)素類生物抑制藥物，對(duì)廢水生物處理過程中的大多數(shù)微生物有明顯的抑制作用，含金霉素的畜禽養(yǎng)殖廢水的生物處理效果較差［3］。厭氧處理工藝是利用厭氧微生物在無氧情況下通過自身代謝過程將廢水中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無機(jī)物和少量細(xì)胞物質(zhì)的過程［4］。厭氧生物處理技術(shù)可用來處理難降解有機(jī)廢水也可以提高廢水可生化性［5］。

目前研究者對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水金霉素對(duì)厭氧微生物的影響機(jī)理尚不清楚，不過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為深入研究環(huán)境系統(tǒng)中的微生物提供了先進(jìn)的技術(shù)手段［6］。已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境微生物的研究［7，8］，但是鮮有利用分子生物學(xué)技術(shù)針對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水中金霉素對(duì)厭氧微生物群落的影響報(bào)道。

通過從受金霉素影響的厭氧顆粒活性污泥中提取總DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-梯度變形凝膠電泳(DGGE)、割膠回收再做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、克隆后測(cè)序以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等新的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)受金霉素影響的厭氧活性污泥中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，獲得厭氧顆粒污泥中細(xì)菌組成和功能以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，從而為進(jìn)一步更好處理畜禽養(yǎng)殖廢水提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厭氧處理工藝及取樣

試驗(yàn)用金霉素購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。試驗(yàn)用顆粒污泥取自長(zhǎng)沙市某畜禽養(yǎng)殖廢水處理廠的UASB反應(yīng)器，在實(shí)驗(yàn)室(35±2)℃穩(wěn)定培養(yǎng) 48 h，污泥濃度為 40.75 g/L。

試驗(yàn)裝置如圖1所示。反應(yīng)瓶容積為500 mL，瓶口用橡膠塞密封，橡膠塞上設(shè)置導(dǎo)管，將產(chǎn)生的氣體引入3%NaOH溶液，以吸收氣體中的CO2，排出的液體即為甲烷產(chǎn)量。向反應(yīng)瓶中加入100 mL活性顆粒污泥、400 mL配水，一定量的金霉素并且搖勻，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，以此探明金霉素對(duì)養(yǎng)殖廢水厭氧消化的抑制作用。根據(jù)金霉素對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)廢水厭氧消化抑制作用的研究［9］，設(shè)置金霉素的濃度分別為 0.4、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/L，編號(hào)分別 1、2、3、4、5進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)照瓶中不添加金霉素，其他條件與受試瓶相同。各反應(yīng)瓶均做平行試驗(yàn)。將反應(yīng)瓶置于恒溫振蕩水浴鍋中，定時(shí)搖動(dòng)以保證污泥處于懸浮狀態(tài)［10］。每天定時(shí)測(cè)定產(chǎn)甲烷量，直至基本停止產(chǎn)氣。每天測(cè)定COD濃度，反應(yīng)結(jié)束后取活性污泥于－20℃保存。

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 Experimental Apparatus

1.2 活性污泥總DNA提取

百泰克試劑盒法:采用土壤基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，具體試驗(yàn)步驟參照說明書，提取完成后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 PCR 擴(kuò)增

采用上海生工合成的細(xì)菌16S rDNA通用引物341F(5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)［11-15］和517R(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)［15-17］直接對(duì)總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中在341F的5’末端加40 bp的 GC夾(5’-CGC CCG CCG GGC CCC GGG CCC GGC CCG CCC CCG CCC G-3’)［12-15］，用于后續(xù)的DGGE。PCR擴(kuò)增體系為Easy Taq DNA Polymeerase(TransGen，北京)1 μL(5 U)，10 × Easy Taq Buffer 5 μL(200 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L KCl、100 mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/L MgSO4)，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL(0.2 mmol/L)，引物為1 μL(20 μmol/L)，模板 DNA 為1 μL，其余用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL體系。PCR反應(yīng)在上擴(kuò)增，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃預(yù)變性30 s;65℃退火1 min;72℃延伸1 min，循環(huán)33次;72℃延伸7 min;4℃保溫。PCR反應(yīng)后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 DGGE 分析

將上面步驟得到的PCR產(chǎn)物在DCode System(Bio-Rad，USA)上進(jìn)行電泳，變性濃度范圍為45% ～65%，聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%，電壓設(shè)置為70 V，電泳時(shí)間為16 h，溫度設(shè)定為60℃。電泳結(jié)束后，凝膠電泳以0.5 μg/mL的溴化乙錠溶液染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

為了了解菌種在受金霉素影響的反應(yīng)器中的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)DGGE條帶圖譜進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，重點(diǎn)對(duì)細(xì)菌種群的豐富度和相關(guān)性進(jìn)行分析。豐富度分析以圖譜中所有的條帶數(shù)為1，不同樣品的細(xì)菌種群豐富度為該樣品的條帶數(shù)除以圖譜中的總條帶數(shù)(同一位置的條帶只能算一條)，具體公式如下。

式中，Rsi為第i泳道的細(xì)菌種群豐富度值;

Li為第i條泳道上的條帶數(shù);

Lt為圖譜中的總條帶數(shù)。

相關(guān)性分析主要分析不同樣品之間細(xì)菌種群的相似性，兩條帶之間的相似系數(shù)可以用Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)(Cs)公式［18，19］計(jì)算。

式中，CSAB為泳道A和泳道B之間的相似性系數(shù);

LAB為泳道A上的與泳道B上位置相同的條帶數(shù);

LA為泳道A上的條帶數(shù);

LB為泳道B上的條帶數(shù)。

1.6 切膠PCR、克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析

在紫外燈下切下DGGE條帶，切下后放入干凈離心管，然后用膠回收試劑盒做膠回收，再對(duì)回收的DNA用不含GC夾的341F和517R進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上，得到的PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。將得到的PCR產(chǎn)物用pEASY-T1 Cloning Kit(TransGen，北京)進(jìn)行克隆，最后對(duì)挑選的克隆子送交測(cè)序公司(Sangon，上海)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI獲得接受號(hào)。使用 NCBI的 GenBank的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建NJ樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行情況

厭氧反應(yīng)器馴化結(jié)束后，投加不同量的金霉素，連續(xù)運(yùn)行7 d，每天監(jiān)測(cè)運(yùn)行參數(shù)(包括pH、COD和產(chǎn)甲烷量)，第8 d后產(chǎn)甲烷體積忽略不計(jì)且COD的變化也甚微。具體結(jié)果如圖2、圖3所示，圖2縱坐標(biāo)為產(chǎn)甲烷體積以10為底的對(duì)數(shù)，圖3縱坐標(biāo)為COD的濃度以10為底的對(duì)數(shù)。

圖2 金霉素對(duì)禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理系統(tǒng)甲烷產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of Chlortetracycline on Methane Yield in Livestock Wastewater in Anaerobic Biological Treatment System

圖3 禽養(yǎng)殖廢水厭氧生物處理系統(tǒng)中COD濃度的變化情況Fig.3 Changes of COD Concentration in Anaerobic Biological Treatment System

由圖2可知在系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的前5 d對(duì)照組的產(chǎn)甲烷量明顯高于試驗(yàn)組，計(jì)算得 1、2、3、4、5、6 組的CH4的 總 產(chǎn) 量 分 別 是 242、232、220、196、184、260 mL，試驗(yàn)組與對(duì)照組的差值率分別是6.9%、10.8%、15.4%、24.6%、29.2%，說明金霉素對(duì)厭氧微生物產(chǎn)甲烷的能力起到抑制作用;隨著金霉素濃度的增加，其抑制作用依次增大，兩者成正比例關(guān)系。到第6 d時(shí)所有的試驗(yàn)瓶基本停止產(chǎn)氣。由圖3可知COD在第1、2 d時(shí)降解速度最快，第3 d后平穩(wěn)降解，對(duì)照組COD的濃度明顯低于金霉素的試驗(yàn)組，試驗(yàn)組的COD去除率分別是90.89%、89.02%、88.93%、87.95%、86.96%，對(duì)照組的 COD 去除率達(dá)到94.46%，這說明金霉素對(duì)厭氧微生物處理COD的能力起到抑制作用。隨著金霉素濃度的增加，其抑制作用依次增大，兩者是正比例關(guān)系，與其對(duì)產(chǎn)甲烷能力的趨勢(shì)是一致的。

2.2 DNA提取以及PCR擴(kuò)增

提取的污泥微生物DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明初提的微生物總DNA片段長(zhǎng)度正常，且獲得了較高的量(如圖4a)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖電泳后以溴化乙錠(EB)溶液染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照，由圖4b可知PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為250 bp左右。

圖4 DNA提取和PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的瓊脂糖電泳圖Fig.4 Map of DNA and PCR Products after Agarose Gel Electrophoresis

2.3 DGGE圖譜的細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)分析

在Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)下，使用Quantity One V4.52(Bio-Rad，USA)軟件對(duì)經(jīng)溴化乙錠(0.5 μg/mL)染色的DGGE凝膠進(jìn)行成像，在6條泳道上一共觀察到23條不同的條帶如圖5a所示;圖5b是根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)的成像照片，經(jīng)過系統(tǒng)軟件分析后的DGGE圖譜示意圖，各條帶的豐富度值、分布及相關(guān)性分析的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1、表2所示。

由圖5、表1可知在1～5泳道中出現(xiàn)的條帶都可以在第6泳道中找到，金霉素處理組的條帶數(shù)均小于對(duì)照;而且從第1泳道到第5泳道的Rs值開始變小，這說明隨著金霉素濃度的增加，對(duì)細(xì)菌群落的影響在變大，細(xì)菌群落數(shù)量在減少。由表2可知從第1泳道到第5泳道依次與第6泳道的對(duì)照組相比較發(fā)現(xiàn)隨著金霉素濃度的增加，其與對(duì)照組的相似性系數(shù)在減小，同樣可以說明金霉素對(duì)微生物群落產(chǎn)生了抑制作用。

表1 細(xì)菌群落豐富度值Tab.1 Richness Value of Bacterial Community

表2 各組細(xì)菌種群相似性系數(shù)Tab.2 Comparability Index of Bacterial Population in Different Groups

圖5 DGGE凝膠成像圖及DGGE圖譜示意圖Fig.5 Gel Imaging and Analysis Map of DGGE

2.4 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

由于23條帶亮度不同，選取典型且亮度很高的差異性條帶進(jìn)行切膠回收、PCR重?cái)U(kuò)增、克隆后測(cè)序，獲得圖5a中 A、B、C、D、E 中不同的 16S rDNA序列，提交給GenBank注冊(cè)，獲得臨時(shí)登錄號(hào)，條帶與臨時(shí)登錄號(hào)之間對(duì)應(yīng)關(guān)系如表3所示。使用GenBank的BLAST程序，將獲得的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得各序列的同源性信息(表3)，然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建NJ樹，如圖6所示。

表3 序列的BLAST結(jié)果Tab.3 Results of Sequences using BLAST

圖6 根據(jù)序列和BLAST建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic Trees of Bacterial Based on Results of BLAST of Sequences

由表3、圖6可知 C與Burkholderia cenocepacia的親緣關(guān)系比較接近，而C在1、2、3、4、對(duì)照組中的條帶比較弱，這與Chopra等［20］研究發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗生素促使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性是一致的;A與Nitrosomonas eutropha的親緣關(guān)系比較接近，是硝化過程中一類常見的自養(yǎng)菌，它可以從氧化氨氮的過程中獲得能量而生長(zhǎng)繁殖，A在6組中均有此類，這與Purkhold等［21］在研究金霉素影響氨氧化細(xì)菌多樣性的調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)了此菌種;B、C、E在BLAST比對(duì)與Uncultured bacterium的親緣性比較接近，是一類不能純培養(yǎng)的細(xì)菌，此類的細(xì)菌與Burkholderia cenocepacia和Nitrosomonas eutropha也存在一定的親緣關(guān)系，說明此類細(xì)菌在金霉素的影響下產(chǎn)生耐藥性，組成了整個(gè)厭氧活性污泥細(xì)菌多樣性，且對(duì)于廢水的除碳氮有著一定的作用。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過一段時(shí)間的連續(xù)監(jiān)測(cè)，受到金霉素影響的試驗(yàn)組會(huì)比對(duì)照組的COD濃度要高，產(chǎn)甲烷量要小，而且是隨著金霉素濃度的增加，產(chǎn)甲烷量差值從6.9%擴(kuò)大到29.2%，COD去除率從90.89%降至86.96%，而對(duì)照組COD去除率達(dá)到94.46%。

(2)通過PCR-DGGE技術(shù)對(duì)厭氧活性污泥中細(xì)菌多樣性統(tǒng)計(jì)的分析，發(fā)現(xiàn)隨著金霉素濃度的增加，厭氧活性污泥中的細(xì)菌種群豐富度Rs從0.913到0.652;對(duì)各組的系數(shù)比較也可以看出隨著金霉素濃度的增加，其與對(duì)照組的差距也在增大，相似性系數(shù) CS從97.6 到 78.9。

(3)PCER-DGGE技術(shù)對(duì)于監(jiān)測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)合DNA測(cè)序、序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育性分析對(duì)厭氧活性污泥中微生物做出種屬鑒定［6］，可為研究畜禽養(yǎng)殖廢水中金霉素處理機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

［1］段妮娜，董濱，何群彪，等.規(guī)?；B(yǎng)豬廢水處理模式現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)［J］.凈水技術(shù)，2008，27(4):9-15，37.

［2］顏智勇，吳根義，劉宇賾，等.UASB/SBR/化學(xué)混凝工藝處理養(yǎng)豬廢水［J］.中國(guó)給水排水，2007，23(14):66-68.

［3］孫建平，鄭平，胡寶蘭.金霉素對(duì)豬場(chǎng)廢水厭氧消化抑制作用［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，42(4):652-655

［4］王寶貞.水污染治理新技術(shù)、新工藝、新概念、新理論［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［5］Speece R E.李亞新譯.工業(yè)廢水的厭氧生物技術(shù)［M］.北京:中國(guó)建筑工業(yè)出版社，2001.

［6］肖勇，楊朝暉，曾光明，等.PCR-DGGE研究處理垃圾滲濾液序批式生物膜反應(yīng)器(SBBR)中的細(xì)菌多樣性［J］.環(huán)境科學(xué)，2007，28(5):1095-1101.

［7］Kawai M，Matsutera E，Kanda H，et al.16S ribosomal DNA-based analysis of bacterial diversity in purified water used in pharmaceutical manufacturing processes by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis ［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2002，68(2):699-704.

［8］蘇俊峰，馬放，王弘宇，等.利用 PCR-DGGE技術(shù)分析生物陶粒硝化反應(yīng)器中微生物群落動(dòng)態(tài)［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(3):386-390.

［9］孫建平.抗生素與重金屬對(duì)豬場(chǎng)廢水厭氧消化的抑制效應(yīng)及其調(diào)控對(duì)策［D］.杭州:浙江大學(xué)，2009.

［10］朱曉磊，王路光，王靖飛，等.土霉素對(duì)厭氧生物處理的抑制作用研究［J］.中國(guó)給水排水，2010，26(1):93-95.

［11］Yoshida N，Yagi K，Sato D，et al.Bacterial communities inpetroleum oil in stockpiles［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，99(2):143-149.

［12］Ishii K，F(xiàn)ukui M.Opt imization of annealing temperature to reducebias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(8):3753-3755.

［13］Veeh R H，Sumithraratne P.Monitoring of microbial souring in chemically treated，produced-water biofilm systems using molecular techniques［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2005，32(4):163-170.

［14］Ferris M J，Muyzer G，Ward D M.Denaturant gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial community［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(1):340-346.

［15］Muyzer G，Brinkhoff T，Ulrich N，et al.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)in microbialecology［J］.Molecular Microbial Ecology Manual，1998，34(4):1-27.

［16］Suzuki K，Koyanagi M，Yamashita H.Genetic characterization and specific detect ion of beer-spoilage Lactobacillus sp.LA2 and related strains［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(4):677-683.

［17］Hashizume T，Takai C，Naito M，et al.Characteristics of the mucus layer on the surface of the bluegill(Lepomis macrochirus)and the bacterial flora in the mucus［J］.Microbes and Environments，2005，20(1):69-80.

［18］Gillian D C，Speksnijder A G C L，Zwart G，et al.Genetic diversity of the biofilm covering Montacuta ferruginosa(Mollusca，Bivalvia)as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and cloning of PCR amplified gene fragment coding for 16SrDNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(9):3464-3472.

［19］Murray A E，Hollibaugh J T，Orrego C.Phylogenetic composition of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(7):2676-2680.

［20］Ian Chopra，Marilyn Roberts.Tetracycline Antibiotics:Mode of Action，Applications，Molecular Biology，and Epidemiology of Bacterial Resistance［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2001，65(2):232-260.

［21］Purkhold U，Pommerening-R?ser A， Juretschko S， et al.Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amoA sequence analysis:implications for molecular diversity surveys［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(12):5368-5382.