王保玉,陳林勇,邰 超,3,韓作穎,關(guān)嘉棟,趙 晗

(1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)地球科學(xué)與測(cè)繪工程學(xué)院,北京 100083;2.國(guó)家能源煤與煤層氣共采技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 晉城 048204;3.河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,河南焦作 454000)

外源菌群煤生物氣化初步研究:菌群結(jié)構(gòu)、煤種及煤孔(裂)隙

王保玉1,2,陳林勇2,邰 超2,3,韓作穎2,關(guān)嘉棟2,趙 晗2

(1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)地球科學(xué)與測(cè)繪工程學(xué)院,北京 100083;2.國(guó)家能源煤與煤層氣共采技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 晉城 048204;3.河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,河南焦作 454000)

以河南義馬煤礦、山西山陰煤礦和雙柳煤礦不同煤階煤為研究對(duì)象,利用沼液經(jīng)逐步馴化得到的外源產(chǎn)甲烷菌群為菌源,在千克級(jí)的水平上進(jìn)行了煤生物氣化模擬實(shí)驗(yàn)。采用16S rDNA測(cè)序?qū)︸Z化得到的菌源進(jìn)行初步確定,并研究了馴化菌源對(duì)不同煤種的氣化效果,采用掃描電鏡初步研究了馴化微生物形態(tài)與煤孔(裂)隙的可能作用。結(jié)果表明,不同煤樣外源菌群煤生物氣化均存在產(chǎn)氣周期,可分為快速、緩慢和抑制3個(gè)階段,而不同煤種氣化階段存在明顯差異。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示,甲烷絲狀菌屬(Methanothrix)占0.02%,而典型的和煤的骨架芳香結(jié)構(gòu)降解相關(guān)的微生物類群占約8%,表明降解步驟是煤生物氣化的速控步驟。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),馴化后的菌群以球狀和桿狀為主,部分微生物進(jìn)入煤的孔裂隙。當(dāng)以塊狀煤為底物長(zhǎng)期馴化菌源時(shí),菌群的產(chǎn)氣效率明顯降低。

煤;微生物成氣;菌群結(jié)構(gòu);煤種;煤孔隙;菌群活性

利用生物作用把煤轉(zhuǎn)變成氣體燃料(例如甲烷)的技術(shù),被稱為“煤生物氣化”,是煤炭綜合加工利用的一種新的嘗試和努力,盡管距離其最終目標(biāo)實(shí)現(xiàn)煤的地下生物氣化尚有一定的距離,但與傳統(tǒng)的煤氣化技術(shù)相比,該技術(shù)低能耗、綠色、環(huán)保,具有探索的價(jià)值。Scott等的研究表明,次生生物氣是煤層氣的一個(gè)重要來(lái)源[1],說(shuō)明煤具有生物氣化的潛力。近年來(lái),生物成因煤層氣越來(lái)越受到國(guó)際煤層氣領(lǐng)域的關(guān)注[2],針對(duì)煤生物氣化的研究,從菌源來(lái)看可以分為外源產(chǎn)甲烷菌群和煤層天然本源微生物,兩種來(lái)源的微生物均可實(shí)現(xiàn)煤的氣化[3-7]。

筆者以河南義馬煤礦、山西山陰煤礦和雙柳煤礦不同煤階煤為研究對(duì)象,利用自制沼液經(jīng)逐步馴化得到的外源產(chǎn)甲烷菌群為菌源,在千克級(jí)的水平上進(jìn)行了煤生物成氣模擬實(shí)驗(yàn)。采用16S rDNA測(cè)序?qū)︸Z化得到的菌源進(jìn)行初步確定,并研究了馴化菌源對(duì)不同煤種的氣化效果,采用掃描電鏡初步研究了馴化微生物形態(tài),探討了煤孔(裂)隙的可能作用。

1 實(shí)驗(yàn)方案

1.1 煤樣與菌群

實(shí)驗(yàn)用煤樣采自河南義馬煤礦、山西大同山陰煤礦、呂梁雙柳煤礦,塊狀煤直徑5～15 cm,堆放半年以上,煤工業(yè)分析結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出,從揮發(fā)分產(chǎn)率(Vdaf)看,義馬和大同的煤樣煤階要低于呂梁煤樣。

表1 煤樣的工業(yè)分析結(jié)果Table 1 The proximate analysis of coal sample %

秸稈采自山西晉城市田間,將義馬煤樣進(jìn)行粉碎,對(duì)其中85～100目的煤粉進(jìn)行氣化實(shí)驗(yàn),大于100目的煤粉用于菌群的馴化實(shí)驗(yàn)。厭氧菌群采用實(shí)驗(yàn)室自制的小型沼氣池的沼液進(jìn)行馴化。

1.2 營(yíng)養(yǎng)液

1 L純水中加入抗壞血酸0.5 g,EDTA 0.5 g,酵母粉2 g,K2HPO42.9 g,KH2PO41.5 g,NH4Cl 1.8 g, MgCl20.4 g,微量元素液100 μL,維生素液50 μL。

微量元素:FeSO4·7H2O 21 g;ZnCl20.7 g; MnSO4·H2O 1 g;CoCl2·6H2O 1.9 g;CuSO4·5H2O 0.03 g;NiCl2·2H2O 0.24 g;Na2MO4·2H2O 0.36 g; KAl(SO4)20.1 g;H3BO30.06 g;純水100 mL。

維生素:硫辛酸0.05 g,維生素B12 0.001 g,鹽酸吡多辛0.1 g,生物素0.02 g,煙酸0.05 g,葉酸0.02 g,D-泛酸鈣0.05 g,對(duì)氨基苯甲酸0.05 g,純水100 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 厭氧菌群馴化

將500 g采集的秸稈切碎,長(zhǎng)度約為5 cm,用清水沖洗掉其上的泥土等殘?jiān)笱b入18 L密閉容器,加入10 L培養(yǎng)基,500 g新鮮豬糞,曝氮?dú)?0 min,密封,8 d后,以大于100目的褐煤煤粉為底物進(jìn)行逐步馴化[8-9],得到實(shí)驗(yàn)用厭氧菌源。

1.3.2 微生物基因組提取及16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序

DNA的提取采用試劑盒(EZNA water DNA kit), 16S rDNA V6高變區(qū)片段擴(kuò)增引物為V6-F(5’-CAACGCGARGAACCTTACC-3’),V6-R(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:TaKaRaEx Taq Buffer(含鎂、含dNTPs)25 μL,引物(10 μmol/L)各1.5 μL,模板2 μL,加無(wú)菌水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min,98℃變性10 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,共31個(gè)循環(huán),最后在72℃延伸2 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),測(cè)序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.3.3 生物成氣模擬實(shí)驗(yàn)

在140 L自制發(fā)酵罐中,進(jìn)行生物成氣模擬實(shí)驗(yàn)。其中,煤樣30 kg,加入60 L營(yíng)養(yǎng)液,曝氮?dú)?0 min,用蠕動(dòng)泵泵入10 L馴化液,再曝氣10 min。發(fā)酵罐溫度35℃,用5 L氣袋收集產(chǎn)生的氣體,用氣相色譜進(jìn)行氣體成分分析。

1.3.4 生物作用后煤樣的掃描電鏡觀察

取微生物作用后的大小合適的煤塊,利用25%, 50%,75%,95%的乙醇對(duì)其上的微生物進(jìn)行梯度脫水后[10]利用掃描電鏡觀察。

1.3.5 不同時(shí)間馴化液活性實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵罐模擬產(chǎn)氣約28 d為一個(gè)周期,30 kg義馬煤塊每完成一個(gè)產(chǎn)氣周期,將30 L馴化液排出,重新補(bǔ)加等量的營(yíng)養(yǎng)液,作為菌源隨時(shí)取用。在100 mL厭氧瓶中,加入1.5 g的85～100目義馬煤粉,57 mL營(yíng)養(yǎng)液,曝氣1 min后放入DWS厭氧工作站,接種1個(gè)月的馴化液5 mL,35℃恒溫培養(yǎng),每隔4～5 d取氣體樣品測(cè)量甲烷含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將厭氧瓶中的氣體導(dǎo)出。以第12個(gè)月的馴化液為菌源重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 氣體成分測(cè)定

儀器選用美國(guó)Angilent 7890氣相色譜儀,配Carbonplot色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和TCD檢測(cè)器,氣密針進(jìn)樣,進(jìn)樣量0.5 mL。色譜進(jìn)樣口溫度150℃,柱溫箱溫度25℃,檢測(cè)器溫度200℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 微生物16S rDNA測(cè)序結(jié)果分析

馴化液的測(cè)序結(jié)果顯示微生物主要分布在細(xì)菌域(82.44%),少數(shù)分布在古菌域(0.02%),還有部分不確定(17%)。古菌域的0.02%全部是甲烷絲狀菌(Methanothrix)。在檢測(cè)到的細(xì)菌域20個(gè)門(Phylum)中,變形菌門(Proteobacteria)占22.93%,厚壁菌門(Firmicutes)占18.11%,螺旋體門(Spirochaetes)占10.98%,擬桿菌門(Bacteroidetes)占10.42%,放線菌門(Actinobacteria)占2.17%,硝化螺菌門(Nitrospira)占1.23%,其他菌門占比均小于1%(圖1)。變形菌門的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(2.08%)、互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)(0.25%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)(0.76%)等,放線菌門的分枝桿菌屬(Mycobacterium),諾卡氏菌(Nocardia)(0.08%)等,擬桿菌門的黃桿菌屬(Flavobacterium)(0.12%)等,厚壁菌門的芽孢桿菌屬 (Bacillus)(0.12%)、梭 菌 屬 (Clostridium) (3.15%)等,在多環(huán)芳烴等難降解有機(jī)物的生物降解中起重要用[11-15],硝化細(xì)菌可促進(jìn)水中溶解性含氮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[16-17],螺旋體門的螺旋體屬可降解碳水化合物產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸、氫氣和二氧化碳[18-20]。

圖1 馴化液菌群結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacteria communities of the domesticated microbes

煤的生物降解多基于煤的基本結(jié)構(gòu)單元含類木質(zhì)素、芳環(huán)和一些官能團(tuán)[20-23],煤的降解結(jié)果也顯示其芳環(huán)縮合度降低,脂肪鏈斷裂,含氧官能團(tuán)減少[24]。馴化液中含有產(chǎn)甲烷必要的菌群,典型的產(chǎn)甲烷菌群占整個(gè)菌群比約8%。甲烷絲菌屬僅占0.02%可能有兩方面原因:①產(chǎn)甲烷菌是產(chǎn)甲烷生物鏈上的最后一個(gè)環(huán)節(jié),不是速控步驟;②PCR擴(kuò)增的引物是細(xì)菌的通用引物,對(duì)古菌的擴(kuò)增效果不理想。

2.2 生物氣化模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究表明,無(wú)煙煤中的天然產(chǎn)甲烷菌群產(chǎn)氣可達(dá)到85 d[5]。褐煤中的天然產(chǎn)甲烷菌群的一個(gè)產(chǎn)氣周期為55 d左右,一個(gè)產(chǎn)氣周期又可以分為生氣量緩慢增長(zhǎng)、顯著增高、趨于減緩3個(gè)階段[4],這與本研究中實(shí)驗(yàn)室模擬的外源產(chǎn)甲烷菌群產(chǎn)氣規(guī)律不同,外源產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)氣周期較短,一般在28 d左右(圖2,圖中百分?jǐn)?shù)代表甲烷含量)。原因可能有兩方面:①上述文獻(xiàn)中的煤為粉末狀,比表面積大,有利于微生物的作用;②經(jīng)過(guò)馴化的外源產(chǎn)甲烷菌群對(duì)煤的降解效果比天然產(chǎn)甲烷菌群強(qiáng),降解速度較快。

圖2 不同煤樣成氣效果Fig.2 The gas production of different coal samples

從圖2可以發(fā)現(xiàn),3種煤樣的產(chǎn)氣均可以分為3個(gè)階段:產(chǎn)氣速率快速增高、緩慢升高、趨于停止。義馬煤樣第1階段為0～7 d,第2階段為8～21 d,第3階段為22～28 d。大同和呂梁煤樣第1階段為培養(yǎng)開始至6～10 d,第2階段為11～21 d,第3階段為22～28 d。

快速成氣階段的出現(xiàn)可能與微生物培養(yǎng)基中的有機(jī)質(zhì)有關(guān),培養(yǎng)基中的相對(duì)于煤來(lái)說(shuō)分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,易于被微生物利用,實(shí)現(xiàn)了第1階段的的快速產(chǎn)氣。而在第2個(gè)階段中,微生物開始利用煤中可降解的部分產(chǎn)氣,直到第22天產(chǎn)氣基本停止,其原因可能是因?yàn)槲⑸锏拇x產(chǎn)物積累,產(chǎn)生了反饋抑制。

值得注意的是,煤階較高的呂梁和大同煤樣氣化的第1階段末期即6～10 d出現(xiàn)了相對(duì)平穩(wěn)的階段,這可能是由于相對(duì)于低階煤,較高階煤降解需要較長(zhǎng)的時(shí)間。有關(guān)煤生物成氣特征與煤炭基質(zhì)及微生物來(lái)源方面的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

2.3 微生物作用后煤樣的掃描電鏡觀察

生物氣化是一個(gè)由多種微生物構(gòu)成的菌群共同完成的過(guò)程。如圖3所示,菌群以球狀和桿狀微生物為主。圖3(a)中的桿菌長(zhǎng)為 1.899 μm,直徑為736.9 nm;圖3(b)中的兩個(gè)球菌直徑分別為742.3和737.2 nm;圖3(c)中的裂隙寬度為2.072 μm,孔隙直徑為 744.8 nm;圖 3(d)中的球菌直徑為915.5 nm,裂隙寬度為2.539 μm。

圖3 微生物處理后煤表面微生物Fig.3 Representative SEM micrographs of coal and microbes on the coal surface

可以發(fā)現(xiàn):①部分微生物可進(jìn)入煤中的一些孔隙;②孔隙占煤體積的比例小?，F(xiàn)有的理論認(rèn)為,難降解的高分子物質(zhì)能被微生物降解的前提是能與微生物或其胞外酶接觸。因此,與相同質(zhì)量的煤粉相比,以塊狀煤為底物時(shí)比表面積小,對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)有效基質(zhì)量就少。當(dāng)能與微生物接觸部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用完,而煤塊內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能被利用時(shí),產(chǎn)氣周期就有可能結(jié)束,以此時(shí)的塊煤作為底物馴化外源產(chǎn)甲烷菌群時(shí),菌源的活性可能降低。

2.4 不同時(shí)間馴化液活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以義馬煤為研究對(duì)象,對(duì)馴化時(shí)間對(duì)馴化液產(chǎn)甲烷活性的影響進(jìn)行了初步研究,結(jié)果如圖4所示。從圖4(a)可以看出,在初始馴化階段實(shí)驗(yàn)組甲烷含量的上升明顯高于對(duì)照組,且實(shí)驗(yàn)組的甲烷終含量為25.5%,也高于對(duì)照組16.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將厭氧瓶中的氣體導(dǎo)出,實(shí)驗(yàn)組導(dǎo)出氣體61 mL,對(duì)照組導(dǎo)出37 mL。說(shuō)明外源產(chǎn)甲烷菌群可以利用褐煤煤粉產(chǎn)氣。

如圖4(b)所示,以12個(gè)月的馴化液為菌源時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的產(chǎn)氣速率差別不大,甲烷終含量實(shí)驗(yàn)組為29.4%,對(duì)照組為30.5%,對(duì)照組略高于實(shí)驗(yàn)組,且兩組均未能從厭氧瓶中導(dǎo)出氣體。

圖4 馴化初、末期馴化液成氣效果Fig.4 The gas production by the tail domestication microbes

兩組實(shí)驗(yàn)所用的底物及營(yíng)養(yǎng)液相同,菌源不同。出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是:隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),可提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的煤的有效基質(zhì)基本被完全消耗,馴化得到的可以降解煤的部分微生物逐漸失去了優(yōu)勢(shì),第12個(gè)月馴化液中的菌群只能利用營(yíng)養(yǎng)液,煤粉的存在甚至部分抑制了微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)液的利用。

3 結(jié) 論

(1)外源產(chǎn)甲烷菌群進(jìn)行塊煤的生物氣產(chǎn)出模擬時(shí),產(chǎn)氣周期為28 d左右;培養(yǎng)開始至7～10 d為產(chǎn)氣周期的第1個(gè)階段,微生物利用營(yíng)養(yǎng)液產(chǎn)氣。第1階段末期至產(chǎn)氣的21 d為第2階段,微生物利用煤產(chǎn)氣,22～28 d,產(chǎn)氣趨于停止。

(2)利用馴化的菌源降解煤產(chǎn)氣,其馴化液中含有典型的產(chǎn)甲烷菌群;部分微生物可以進(jìn)入煤的一些孔隙結(jié)構(gòu),因此煤的孔隙結(jié)構(gòu)決定了煤有效基質(zhì)的量,對(duì)產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量有重要影響。

(3)塊狀煤馴化的菌液到第12個(gè)月菌源活性降低。原因在于煤塊的有效部分是其外表面及孔隙部分,有效基質(zhì)被利用完后,不經(jīng)過(guò)處理的塊煤不能再用于產(chǎn)氣或微生物馴化。

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A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria: Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture

WANG Bao-yu1,2,CHEN Lin-yong2,TAI Chao2,3,HAN Zuo-ying2,GUAN Jia-dong2,ZHAO Han2

(1.College of Geosciences and Surveying Engineering,China University of Mining and Technology(Beijing),Beijing 100083,China;2.State Energy Key Laboratory of Joint Exploitation of Coal and Coal-bed Methane,Jincheng 048204,China;3.Institute of Resources and Environment,Henan Polytechnic University,Jiaozuo 454000,China)

With the coal samples from Yima in Henan Province,Shanyin in Shanxi Province and Shuangliu in Shanxi Province,the biological coal gasification by exogenous bacteria were studied at the kilogram levels.The microbiome composition was identified by 16S rDNA method.Morphology of microorganisms and the interaction of microorganisms and coal were investigated by scanning electron microscope.The results show that the biological coal gasification by exogenous bacteria can be divided into three stages:a rapid growth stage,a stable stage,and an inhibition stage.There are apparent differences at the three stages between the different coal samples.16S rDNA sequence analysis show that Methanothrix accounts for only 0.02%,while other typical microorganisms related to degradation of coal account for 8%.Scanning electron microscope observation show that the microorganisms are mainly spherical and rod-shaped.Some of the microorganisms can enter the coal fissure/pore,which account for a small proportion of coal.With the lump coal for thesubstrate long-term domestication bacterium source,the gas efficiency of bacteria obviously decreases.

coal;biogenic gas;microbiome composition;coal type;fissure;microbial activity

TQ53;P618.11

A

0253-9993(2014)09-1797-05

2014-05-02 責(zé)任編輯:畢永華

山西省煤層氣聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(2013012016,2012012013);河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(122300410241)

王保玉(1960—),男,河南周口人,高級(jí)工程師。Tel:0356-2689298,E-mail:wbyjmjt@163.com。通訊作者:邰 超(1978—),男,河南南陽(yáng)人,副教授。Tel:0356-2689298,E-mail:taichao@126.com

王保玉,陳林勇,邰 超,等.外源菌群煤生物氣化初步研究:菌群結(jié)構(gòu)、煤種及煤孔(裂)隙[J].煤炭學(xué)報(bào),2014,39(9):1797-1801.

10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009

Wang Baoyu,Chen Linyong,Tai Chao,et al.A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria:Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture[J].Journal of China Coal Society,2014,39(9):1797-1801.doi:10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009