王 威，錢 斐，李倚云，聞琍毓

(揚州市藥品檢驗所，揚州225009)

替比培南匹伏酯顆粒微生物限度檢查方法的驗證實驗研究*

王 威1，錢 斐2，李倚云2，聞琍毓2

(揚州市藥品檢驗所，揚州225009)

目的:建立替比培南匹伏酯顆粒微生物限度檢查方法。方法:按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法中細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法進行驗證。采用平皿法、離心沉淀法、薄膜過濾法及方法聯(lián)合使用，以試驗菌株菌數(shù)回收率不低于70%為要求，進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法選擇，以試驗組中檢出大腸埃希菌為目標(biāo)對控制菌進行方法試驗。細菌計數(shù)、控制菌檢查采用離心沉淀法聯(lián)合薄膜過濾法;霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法。結(jié)果:計數(shù)方法驗證中試驗組的五種菌株回收率均大于70%，控制菌檢查試驗組中檢查出陽性對照菌。結(jié)論:建立的微生物限度檢查方法可靠、準(zhǔn)確，可作為替比培南匹伏酯顆粒微生物限度檢查方法。

替比培南匹伏酯，微生物限度檢查，驗證實驗，控制菌，薄膜過濾法

碳青霉烯類抗生素是20世紀(jì)70年代開發(fā)的β－內(nèi)酰胺類抗生素［1］，其中替比培南匹伏酯是廣譜抗菌藥物，最早由美國輝瑞開發(fā)，日本在2009年上市，適用于治療對青霉素敏感或耐藥肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌所致感染，尤其是兒科患者耳、鼻、喉和上呼吸道感染［2］。

替比培南匹伏酯顆粒為口服制劑，對其受微生物污染的情況進行考查，根據(jù)《中國藥典》2010年版的要求，需要對藥品微生物限度檢驗方法進行相應(yīng)的驗證，建立檢驗方法。對具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查，首先應(yīng)去除抗菌活性。目前尚未見有關(guān)替比培南匹伏酯顆粒微生物限度檢查方法完整研究的報道，為建立替比培南匹伏酯顆粒微生物限度檢查方法，參考《中國藥典》等［3］文獻，以試驗菌的回收測定為依據(jù)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的有效性驗證，并對控制菌檢查方法進行了驗證試驗。建立科學(xué)、合理的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，有利于對藥品的染菌程度和安全性進行質(zhì)量評價［4］，同時對促進該制劑質(zhì)量控制水平的提高具有實際價值。

1 實驗材料及儀器

1.1 儀器凈化工作臺(吳江市凈化設(shè)備廠)，HTY 2000型智能集菌儀，多次使用集菌器，一次性薄膜過濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司);高壓蒸汽滅菌器，生化培養(yǎng)箱，霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)，電熱恒溫干燥箱(南京實驗儀器廠)，離心機(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 供試樣品替比培南匹伏酯顆粒(規(guī)格50 mg，揚州市某藥業(yè)有限公司，批號120501、120502、120503)。

1.3 試驗用菌株大腸埃希菌(Escherichia coli)［［CMCC(B)44l02］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、白色念珠菌(Candida albican)［CMCC(F)98001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基及沖洗液營養(yǎng)瓊脂(120531)、營養(yǎng)肉湯(111214)、玫瑰紅鈉瓊脂(110630)、改良馬丁(111102)、膽鹽乳糖(BL)(1104122)、4－甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基(110325)、pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液(1209272)，均由北京三藥科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

方法參照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法計數(shù)方法的驗證、控制菌檢查方法的驗證。

2.1 菌液制備取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100 cfu/ml。取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～28 h的白色念珠菌的改良馬丁培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100 cfu/ml。取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加適量含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋為50～100 cfu/ml的孢子懸液。

2.2 供試液制備取每批次樣品各10 g，分別加pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 ml，搖勻，作為1∶10的供試液①。分別取1∶10供試液①，500 r/min離心3 min(低速離心)，取全部上層液，為1∶10供試液②。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證試驗及結(jié)果 為選擇能有效去除替比培南匹伏酯抑菌活性的方法，采用了平皿法、低速離心沉淀法處理供試液與平皿稀釋法聯(lián)用及與薄膜過濾法聯(lián)用，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的細菌代表菌、白色念珠菌、黑曲霉的真菌代表菌進行活菌計數(shù)回收試驗，比較幾種方法對各菌的回收結(jié)果，確定敏感菌株，并選擇出回收率在70%以上的方法作為可去除抑菌活性的有效方法。

2.3.1 平皿法平皿中加入1∶10供試液①1 ml，分別各加入試驗菌50～100 cfu，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每種試驗菌平行制備2個皿，作為試驗組。不加入供試液，同法測定相應(yīng)加入的試驗菌數(shù)，為菌液組;不加入試驗菌，同法測定供試液1 ml中的本底菌數(shù)作為供試品對照組;計算回收率:試驗組回收率(%)=［(試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)］×100%。

2.3.2 低速離心沉淀聯(lián)用平皿稀釋法分別取1∶10供試液②1和0.2 ml加入平皿，以下操作按平皿法。

2.3.3 低速離心沉淀聯(lián)用薄膜過濾法取1∶10供試液②1 ml分別加入裝有約50 ml沖洗液的濾器中，過濾，用40～45℃保溫的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，每次約50 ml，在最后1次沖洗液中加入1 ml含50～100 cfu試驗菌的菌懸液，過濾，取膜菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平板，平行制備2個膜;取1 ml菌懸液同法操作，作為稀釋劑對照組;取供試液②1 ml同法操作，作為供試品對照組;取菌懸液加入平皿作為菌液組，計算試驗組和稀釋劑對照組的回收率。稀釋劑對照組回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2.3.4 結(jié)果平皿法3批樣品的白色念珠菌回收率分別為90%、84%和87%;黑曲霉菌回收率分別為99%、80%和76%，見表1;大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均為0;采用低速離心沉淀聯(lián)用平皿稀釋方法供試液加入1 ml的回收率均為0，0.2 ml的回收率均低于70%，見表2。采用低速離心沉淀聯(lián)用薄膜過濾法，試驗組和稀釋劑對照組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均不低于70%，結(jié)果見表3。

由結(jié)果可知，供試品的細菌計數(shù)采用離心沉淀法結(jié)合薄膜過濾法，霉菌及酵母菌計數(shù)采用平皿法。

表1 霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證試驗結(jié)果

表2 細菌計數(shù)方法驗證菌回收率(0.2 ml)結(jié)果

2.4 控制菌檢查驗證試驗方法及結(jié)果取1∶10供試液①10 ml共5份，其中2份分別加入BL增菌培養(yǎng)基100 ml(常規(guī)法)和200 ml(稀釋法)中，1份用500 r/min離心3 min，取出全部上清液加入BL增菌培養(yǎng)基100 ml(離心沉淀法)，均加入大腸埃希菌10～100 cfu;另2份分別用500 r/min離心3 min，取出全部上清液按薄膜過濾法沖洗300 ml(離心聯(lián)合薄膜過濾法)，取膜加入BL增菌培養(yǎng)基100和200 ml，在最后1次沖洗液中加入大腸埃希菌10～100 cfu，均作為試驗組。同時取含10～100 cfu大腸埃希菌菌懸液，不加供試液，分別按上述對應(yīng)方法操作，加入BL增菌培養(yǎng)基中，作為對照組。另取pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10 ml加入100 ml BL增菌培養(yǎng)基中，作為陰性對照組。按《中國藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查法中大腸埃希菌檢查條件進行試驗。結(jié)果各方法的對照組均檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長，試驗組中常規(guī)法、稀釋法、離心沉淀法均未檢出大腸埃希菌，采用離心聯(lián)合薄膜過濾法，100和200 ml增菌培養(yǎng)基中均檢出大腸埃希菌。由結(jié)果可知，控制菌大腸埃希菌檢查采用離心沉淀法聯(lián)合薄膜過濾法，可有效去除供試品的抑菌性。

表3 細菌計數(shù)方法驗證試驗結(jié)果

3 討論

3.1 替比培南匹伏酯為β－內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥，該試驗以《中國藥典》規(guī)定的驗證用菌株分別進行活菌回收率測定。試驗結(jié)果顯示，細菌代表菌株回收率平皿法為0，離心沉淀聯(lián)合平皿法加樣量1 ml為0，0.2 ml均低于20%，說明藥物對細菌有強抗菌活性，采用離心沉淀聯(lián)合薄膜過濾法1∶10供試液1 ml回收率均高于70%;采用平皿法白色念珠菌、黑曲霉的菌回收率均不低于75%，未顯示對真菌有抑菌活性;在控制菌大腸埃希菌檢查驗證試驗中采用了離心沉淀法聯(lián)合薄膜過濾法才檢出陽性菌。故該制劑微生物限度檢查細菌計數(shù)和控制菌檢查采用離心沉淀法聯(lián)合薄膜過濾法、霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)平皿法。

3.2 對于抗生素藥物的微生物限度檢查，多采用薄膜過濾法，去除抑菌物質(zhì)，但要求藥物本身的溶解性要好［5］。在方法學(xué)驗證試驗探索時，采用1∶10供試液①往往出現(xiàn)不溶顆粒物吸附于濾膜表面，即便通過增加沖洗量也無法有效去除抑菌物質(zhì)。而采用離心沉淀聯(lián)合薄膜過濾法，可以先有效去除不溶顆粒物，消除上述不利影響。另外顆粒劑中糖分溶解后，供試液黏度增加，當(dāng)增加沖洗液溫度至40～45℃，可以提高沖洗效果、排除抑菌活性物質(zhì)，分析原因是由于替比培南匹伏酯難溶于水，沖洗液溫度較低時，藥物及輔料溶解不充分，造成藥物不能沖洗干凈。

3.3 在計數(shù)方法驗證試驗中已反應(yīng)出本品對大腸埃希菌的抑菌作用，在控制菌大腸埃希菌檢查中亦體現(xiàn)了這一點。采用離心沉淀與薄膜過濾法可有效消除抑菌作用，達到試驗?zāi)康?。以上建立的方法可有效地控制藥品質(zhì)量，可作為替比培南匹伏酯顆粒的微生物限度檢查方法。

1董耘婷，張永信.碳青霉烯類抗生素的發(fā)展與展望［J］.上海醫(yī)藥，2011，32:316

2胡云建，陳東科，陶鳳榮，等.替比培南匹伏酯的體外抗菌作用研究［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2012，28(12):950

3中國藥典［S］.二部.2010:附錄107

4蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)［M］.北京:華齡出版社，2007:221－227

5孫偉，劉文杰，崔穎，等.β－環(huán)糊精在喹諾酮類抗生素藥品微生物限度檢查方法建立中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2013，33(1):18

Study on microbial limit test method of tebipenem pivoxil granule

Wang Wei1，Qian Fei2，Li Yiyun2，Wen Liyu2
(Yangzhou Institute For Drug Control，Yangzhou 225009)

Objective:To establish a method for the microbial limit test of Tebipenem Pivoxil granule.Methods:The validation on the microbial limit test method was conducted by counting method of bacteria，mycetes and yeasts and also the control bacteria test method，which were all stated in the Appendix of China Pharmacopoeia(2010 edition).By combined use of culture dish method，centrifugal sedimentation method and membrane filtration method，we selected the counting method of bacteria，mold and yeast with a request that the test strains bacteria recovery rate was not lower than 70%.Then，we conducted a method test on the control bateria with the goal to test the escherichia coli in the experimental group.The bacteria counting and control bacteria check were performed by joint use of sedimentation method and membrane filtration method;Molds and yeasts count were conducted by culture dish method.Results:The recoveries of five strains in the test group were more than 70%in the validation of organisms counting method.The positive control bacteria was found in the experimental group of control bacteria check.Conclusions:The established method is accurate and reliable，which can be used for the microbial limit test of Tebipenem Pivoxil granule.

tebipenem pivoxil，microbial limit test，control bacteria，membrane filtration method

R927.11

A

1006-5687(2014)01-0007-04

2013-10-20