黃 正，楊松濱，劉益杰，褚立希，馮 偉，陳世宣

(上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人的一種常見疾病，慢性起病，造成患者關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，通過一定大小和頻率的力學(xué)刺激來治療骨關(guān)節(jié)炎，具有明顯緩解癥狀和改善關(guān)節(jié)功能的作用［1］。但是力學(xué)治療采用多大的力度和頻率，至今尚無定論，而且治療OA的機(jī)制也尚未明確。關(guān)節(jié)軟骨的退變是OA發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制。越來越多的研究表明，軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨的主要組成部分，其凋亡與OA的進(jìn)程關(guān)系密切［2］。在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中，力學(xué)信號(hào)可以通過多種途徑調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化能力。本研究團(tuán)隊(duì)的前期工作中已經(jīng)證實(shí)，短期內(nèi)持續(xù)的壓力能刺激軟骨細(xì)胞增殖，172kPa的持續(xù)壓力下，軟骨細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)［3-6］。但是力學(xué)治療不僅講究加壓力度，施壓的頻率對(duì)治療效果也有影響。因此在持續(xù)性壓力的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同頻率的周期性壓力，對(duì)揭示力學(xué)方法治療OA的機(jī)理研究具有重要意義。本研究將持續(xù)施加的壓力改進(jìn)為施加不同頻率的周期性壓力，觀察不同頻率組的軟骨細(xì)胞增殖和整合素α1β1分泌的差異，進(jìn)一步揭示手法治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器：胎牛血清(GIBCO，美國(guó))，培養(yǎng)液(Hyclone，美國(guó))，Hank＇s液(Solarbio，中國(guó))，雙抗(GIBCO，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))，Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)：311，美國(guó))，超凈臺(tái)(再鑫儀器，VCM-620，中國(guó))，低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf，美國(guó))，熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，型號(hào)：CKX43，日本)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Tek，型號(hào)：ELX900，美國(guó))。

1.2 施加不同頻率的周期性壓力控制裝置：通過前期研究使用的裝置［6］，將壓力定為172kPa，加壓頻率按照分組要求設(shè)置B1 組0.2Hz，B 兩組0.5Hz，B3 組1Hz，B4 組2Hz和 B5 組5Hz。

1.3 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與傳代：①取出生時(shí)間不到12h的新生新西蘭兔2只，處死;②置于75%酒精100mL浸泡15min消毒;③放置在消毒容器里，于超凈臺(tái)中進(jìn)行軟骨分離：剪刀剝離新生兔四肢長(zhǎng)骨，剔除干凈肌肉、肌腱和筋膜等軟組織，用手術(shù)刀分離四肢骨骺端透明軟骨，并盡量切碎成小于1m3碎屑;④軟骨細(xì)胞消化分離：將切碎軟骨組織放入兩個(gè)無菌離心管，每管軟骨體積約為1mL，加入4mL(4倍于軟骨體積)0.25%胰蛋白酶，在37℃水浴鍋中消化約40min，加入4mL培養(yǎng)液(與胰蛋白酶等體積)終止消化，放入低溫高速臺(tái)式離心機(jī)配平后設(shè)定1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，吸除上清液;加入4mL濃度為0.5mg/mLⅡ型膠原酶進(jìn)一步消化，37℃水浴鍋中消化4h后，將液體通過200目篩網(wǎng)過濾，濾下的液體放入離心管再經(jīng)低溫高速臺(tái)式離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，吸棄上清液，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別接種于4個(gè)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放入37℃、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天原代軟骨細(xì)胞貼壁即可換培養(yǎng)液，并于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況?？梢娫浌羌?xì)胞呈小圓、多角等形態(tài)，胞漿淡、飽滿，見圖1。

每天將培養(yǎng)皿在超凈臺(tái)中更換培養(yǎng)液一次，注意無菌操作，避免細(xì)胞污染。一般于24-48h后，顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況良好，細(xì)胞呈梭形。等長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部80-90%左右，即可進(jìn)行消化傳代。傳代使用1：3的比例，傳至第三代細(xì)胞表型穩(wěn)定，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)見圖2。

圖1 原代軟骨細(xì)胞：細(xì)胞剛貼壁，生長(zhǎng)稀疏，形態(tài)呈小圓形、多角形，胞漿淡、飽滿。

圖2 第三代軟骨細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、緊密，形態(tài)呈梭形、長(zhǎng)條形。

1.4 各組軟骨細(xì)胞增殖的測(cè)定：第三代兔軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、表型穩(wěn)定，用0.25%胰酶消化分離后離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min，離心5min，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，按3×105個(gè)/孔密度接種到6孔板，并分為：A組常規(guī)培養(yǎng)不施加壓力，B組172kPa壓力以不同頻率干預(yù)2h/d：B1組頻率0.2Hz，B2組0.5Hz，B3 組1Hz，B4 組 2Hz，B5 組 5Hz)。干預(yù) 3d 后各組按 5×104密度分別接種到96孔板，每組8孔，細(xì)胞過夜貼壁。第2天測(cè)定細(xì)胞增殖：吸棄96孔板培養(yǎng)上液，每孔加入100μL含10%WST-1試劑的培養(yǎng)液，37℃孵育2h后，450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度OD值。根據(jù)各孔的吸光度和對(duì)照孔的比值分析軟骨細(xì)胞的增殖情況。

1.5 各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中整合素α1β1的測(cè)定：軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及傳代同1.4，細(xì)胞消化分離后按3×105個(gè)/孔密度接種到6孔板，分組與干預(yù)方法同1.4。3d后收集各孔細(xì)胞上清液，放入離心管，離心機(jī)按照1500轉(zhuǎn)/min，離心20min，仔細(xì)收集上液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測(cè)定各組培養(yǎng)上清液中整合素α1β1的含量。

2 結(jié)果

2.1 不同頻率的周期性壓力對(duì)兔軟骨細(xì)胞增殖的影響：相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干預(yù)軟骨細(xì)胞2h/d，作用3d后，細(xì)胞 OD 值對(duì)照組 A 組為1.08±0.13，B1組為1.19±0.11，B2 組為1.23 ±0.08，B3 組為1.35 ±0.06，B4 組為1.45 ±0.09，B5組為1.37±0.12。加壓各組與對(duì)照組比較 OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B組各組間OD值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，峰值出現(xiàn)在B4組。見表1。

表1 不同頻率的周期性壓力對(duì)兔軟骨細(xì)胞增殖及整合素α1β1分泌的影響

2.2 不同頻率的周期性壓力對(duì)兔軟骨細(xì)胞分泌整合素α1β1的影響：相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干預(yù)軟骨細(xì)胞2h/d，作用3d后，整合素α1β1水平對(duì)照組A組為3.02±0.26pg/mL，B1組為 3.28 ±0.19pg/mL，B2 組為 3.43 ±0.11pg/mL，B3 組為3.77 ±0.24pg/mL，B4 組為 4.01 ±0.09pg/mL，B5組為3.94±0.13pg/mL，周期性加壓各組與對(duì)照組比較整合素α1β1值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B組各組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，峰值出現(xiàn)在B4組。見表1。

相同大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力刺激兔軟骨細(xì)胞，均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素的含量。其中以2Hz的頻率作用最強(qiáng)。

3 討論

OA是一種慢性、進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率很高，給患者和社會(huì)帶來重大負(fù)擔(dān)。目前已得到共識(shí)的觀點(diǎn)是，關(guān)節(jié)軟骨的退變是導(dǎo)致OA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［7］。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。膠原纖維是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)，能形成復(fù)雜的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，將軟骨細(xì)胞包裹在內(nèi)，使關(guān)節(jié)軟骨能承受壓力、張力及剪切力。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型［8］，這些力學(xué)刺激通過膠原纖維傳導(dǎo)至軟骨細(xì)胞，引起細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理變化，最終調(diào)節(jié)軟骨的退變。

整合素是軟骨細(xì)胞的一種膠原受體，由α和β兩個(gè)亞單位組成，能夠接受來自細(xì)胞外基質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞的力學(xué)刺激信號(hào)。整合素在力學(xué)刺激下與相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白結(jié)合后發(fā)生空間結(jié)構(gòu)改變，介導(dǎo)了軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號(hào)通路，它是軟骨細(xì)胞力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提，并進(jìn)一步調(diào)控軟骨的增殖、分化、生長(zhǎng)、凋亡甚至影響到細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)［9，10］。有研究發(fā)現(xiàn)［11］，整合素作為最重要的細(xì)胞表面力學(xué)刺激受體之一，通過細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架信號(hào)傳導(dǎo)通路，完成力學(xué)刺激的傳導(dǎo)，在防止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，甚至在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生理和病理方面均起著重要的作用［12，13］。已知軟骨細(xì)胞表達(dá)的整合素有：整合素 α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1、α10β1、αVβ3、αVβ5 等，正常成人軟骨細(xì)胞以 β1型整合素表達(dá)為主［11］，特別是 α1β1、α3β1 和 α5β1，因此 α1β1具有很高的研究?jī)r(jià)值。

力學(xué)方法治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制離不開生物力學(xué)和軟骨細(xì)胞研究。軟骨細(xì)胞對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展起著關(guān)鍵作用。軟骨細(xì)胞的增殖分化與力學(xué)刺激有密切關(guān)系，整合素就是揭示這種關(guān)系的關(guān)鍵因子，因此研究力學(xué)方法對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，可以從力學(xué)刺激-整合素-軟骨細(xì)胞-骨關(guān)節(jié)炎這條途徑著手。

在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)撵o水壓力刺激軟骨細(xì)胞，能上調(diào)Ⅱ型膠原、蛋白多糖和糖氨聚糖等mRNA的表達(dá);并且在一定水平內(nèi)靜水壓越高，軟骨細(xì)胞表型越穩(wěn)定［3，4］。周期性力學(xué)刺激能促進(jìn)基質(zhì)合成，而持續(xù)性靜壓力則使基質(zhì)合成減少［14］。Kian［15］對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加24h周期性的牽張力，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原表達(dá)上調(diào)，同時(shí)作為其受體的整合素α1與之同步上調(diào)，而整合素α5則只有較小的變化。馬軍利等［16］研究發(fā)現(xiàn)一定大小和適宜時(shí)間的靜壓力能促進(jìn)整合素α2的表達(dá)，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)、較大的靜壓力則抑制軟骨整合素α2的表達(dá)。這些研究涉及到力學(xué)刺激的大小和作用時(shí)間等參數(shù)，但是沒有深入研究力學(xué)刺激頻率對(duì)軟骨細(xì)胞代謝和基因表達(dá)的影響。

研究力學(xué)方法對(duì)骨關(guān)節(jié)炎治療的機(jī)制，必須同時(shí)闡明力學(xué)大小和刺激頻率對(duì)軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制，二者缺一不可。本研究在前期持續(xù)性壓力對(duì)軟骨細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用同樣加壓力度、不同頻率的周期性壓力刺激軟骨細(xì)胞，研究不同的刺激頻率對(duì)軟骨細(xì)胞增殖以及整合素表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：施加 172kPa，刺激頻率分別 0.2Hz、0.5Hz、1Hz、2Hz、5Hz 的周期性壓力，均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素α1β1的含量。其中頻率為2Hz的周期性壓力作用最強(qiáng)。說明力學(xué)刺激能夠通過上調(diào)整合素α1β1，引起基質(zhì)成分的變化，進(jìn)一步可以上調(diào)軟骨細(xì)胞的增殖作用。但并非頻率越高作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中以2Hz頻率的周期性壓力作用最強(qiáng)。這對(duì)揭示不同頻率的力學(xué)方法對(duì)骨關(guān)節(jié)炎治療效果的機(jī)制具有重要意義，并且在臨床治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，對(duì)采取何種推拿手法，使用多大的力度和頻率進(jìn)行力學(xué)方法治療具有指導(dǎo)意義。但是哪種頻率和多大的力度組合能得到最佳治療效果，還有這種組合的力學(xué)刺激在力學(xué)信號(hào)通路方面的研究尚未闡明，這將成為今后研究的重點(diǎn)和趨勢(shì)。

［1］潘化平，馮慧，曹月龍.手法治療結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，12：2934-2938.

［2］張延輝，高春陽，李少華.骨性關(guān)節(jié)炎患者退變軟骨及滑膜組織中細(xì)胞因子的表達(dá)［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17(37)：6671-6675.

［3］黃正，黃好，傅文彧，等.不同類型靜水壓對(duì)兔軟骨細(xì)胞表型的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2007，15(2)：29-33.

［4］黃正，傅文彧，馮偉，等.循環(huán)靜水壓力對(duì)維持兔軟骨細(xì)胞表型的影響［J］.中國(guó)骨傷，2007，20(3)：180-183.

［5］朱鴻飛，劉益杰，褚立希.力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞整合素亞單位的調(diào)控［J］.中國(guó)骨傷，2011，24(3)：266-268.

［6］劉益杰，馮偉，楊松濱.不同循環(huán)靜壓力對(duì)兔軟骨細(xì)胞整合素 α1β1 的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2012，46(7)：13-15.

［7］Mallen C D，Peat G，Porcheret M.Osteoarthritis［J］.British Journal of General Practice，2008，58：649.

［8］Archer C W，F(xiàn)rancis-West P.The chondrocyte［J］.Int Biochem Cell Biol，2003，35(4)：401-404.

［9］Millward-Sadler SJ，Wright MO，Lee H，et al.Integrinregulated secretion of interleukin 4，novel pathway of mechanotransduction in human articular chondrocyte［J］.Cell Biol，1999，145(5)：483.

［10］Brakebusch C，Bouvard D，Stanchi F，et al.Integrins in invasive growth［J］.Clin Invest，2002，109(8)：999-1006.

［11］Shakibaei M，Csaki C，Mobasheri A.Diverse roles of integrin receptors in articular cartilage［J］.Adv Anat Embryol Cell Biol，2008，197：1-60.

［12］Shewchuk LJ，Bryan S，Ulanova M，et al.Integrin beta3 prevents apoptosis of HL 1 cardiomyocytes under conditions of oxidative stress［J］.Can Physiol Pharmacol，2010，88(3)：324-330.

［13］Garmy Susini B，Avraamides CJ，Schmid MC，et al.Integrin alpha4 beta1 signaling is required for lymphangiogenesis and tumor metastasis［J］.Cancer Res，2010，70(8)：3042-3051.

［14］Shyy J S，Chien.Role f integrins in cellular response to mechonical stress and adhesion［J］.Curr Opin Cell Biol，1997，9：707.

［15］Lahui K，Polotsky A，Hungerford DS，et al.Cyclic strain stimulates proliferative capacity，integrin by human articular chondrocytes from osteoartbrilic knee joins［J］.The University of Pennsylvania Orthopaedic Journal，2002，15：7.

［16］馬軍利，王美青，張曼.靜壓力對(duì)體外培養(yǎng)髁狀突軟骨α2整合素表達(dá)的影響［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20(3)：286.