張玉彪，柳云恩，鞏天星，趙顯威，高燕，侯明曉

（1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，沈陽(yáng) 110016；2.全軍重癥（戰(zhàn)）創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室和遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016；3.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽(yáng) 110004；4.朝陽(yáng)市喀左縣水泉鄉(xiāng)人民政府，朝陽(yáng) 122000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，在體內(nèi)和體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)、肌腱及韌帶等組織。MSCs取材方便，可在體外大量擴(kuò)增，與顆粒骨和磷酸鈣骨水泥的復(fù)合物聯(lián)合培養(yǎng)可作為人工骨移植物。1970年骨水泥開(kāi)始應(yīng)用于臨床［1］，各種骨水泥應(yīng)運(yùn)而生，目前，丙烯酸類樹(shù)脂骨水泥和磷酸鈣骨水泥是臨床填補(bǔ)骨缺損的主要材料［2，3］。磷硅酸鈣水門汀作為一種填充骨缺損的新型材料正處于臨床前階段［4，5］，尚未應(yīng)用于臨床手術(shù)中。磷硅酸鈣水門?。ㄒ?jiàn)圖1）具有良好的生物降解能力和延展性，具有臨床手術(shù)所使用的骨水泥的理化性質(zhì)，在一定程度下隨著利塞膦酸（RA）含量的升高對(duì)骨具有促進(jìn)愈合作用，將一定含量的磷酸二氫鈣（MCP）添加到含利塞膦酸的骨水泥中，能夠增加骨水泥的強(qiáng)度和凝固速度［6，7］。

本實(shí)驗(yàn)所研究的骨水泥材料為納米級(jí)，通過(guò)含利塞膦酸的磷硅酸鈣水門汀的PBS浸提液對(duì)SD大鼠成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，然后提取細(xì)胞RNA進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，研究OPG、RANKL和OC3個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而對(duì)所研究的骨水泥進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，并闡述3個(gè)基因的相互關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 磷硅酸鈣骨水泥顯微結(jié)構(gòu)

圖2 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)3d圖片（×10）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生48h內(nèi)SD大鼠胎鼠，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供。

1.1.2 試劑和儀器 試劑：0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），Ⅱ型膠原酶（美國(guó)sigma公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），DMEM（美國(guó)Hyclone公司），TRIZOL（美國(guó)Cibco公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TARAKA公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（日本TARAKA公司），RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（北京天根公司）。儀器：PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio－Rad公司），核酸蛋白分析儀（美國(guó) Thermo Scientific公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio－Rad公司），振蕩培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司），水平電泳槽（美國(guó)Bio－Rad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司），恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?，超速高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.1.3 引物合成 OC上游引物F：TGCAAAGCC CAGCGACTCT下游引物 R：AGTCCATTGT TGAGGTAGCG擴(kuò)增產(chǎn)物為98bp；OPG上游引物F：CGTCACCCACAGTCTGAGGAA下游引物R：TCAACTGCCATTTCAAGAGCC擴(kuò)增產(chǎn)物為216 bp；β－actin上游引物 F：GAACCCTAAGGCCAAC CGTG下游引物R：AGGCATACAGGGACAAC ACAGC擴(kuò)增產(chǎn)物為104bp；RANKL上游引物F：CCGTGCAAAGGGAATTACAAC下游引物R：GATGGTGAGGTGAGCAAACG擴(kuò)增產(chǎn)物為134 bp，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分離 用SD大鼠胎鼠提取成骨細(xì)胞；無(wú)菌取下胎鼠顱骨放入無(wú)菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質(zhì)，將顱骨剪成泥狀轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，加入5mL 0.25%胰蛋白酶，放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育45min，1 000r／min離心5 min，棄去上清液加入Ⅱ型膠原酶5mL，再放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育30min，1 000r／min離心5min，棄上清液收獲細(xì)胞，將細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2d換液一次，待細(xì)胞傳代至第3代時(shí)（見(jiàn)圖2），進(jìn)行細(xì)胞鑒定，經(jīng)鑒定為成骨細(xì)胞，純度適合本實(shí)驗(yàn)［2］。

1.2.2 骨水泥浸提液的制備 骨水泥使用前160℃高溫干熱滅菌6h，制作1%RA骨水泥模型和15%MCP＋0.5%RA骨水泥模型，并以PBS為浸提液的介質(zhì)分別浸泡7d。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取 將細(xì)胞培養(yǎng)傳代至第3代，將細(xì)胞培養(yǎng)基以7∶1的濃度比與15%MCP＋0.5%RA骨水泥和1%RA骨水泥浸提液混合作為細(xì)胞培養(yǎng)基，置于6孔板中培養(yǎng)，每組6個(gè)平行，培養(yǎng)3d，待6孔板培養(yǎng)細(xì)胞匯合度為90%～100%時(shí)，提取細(xì)胞總RNA。將細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗3次，加入1mLTRIZOL，適當(dāng)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，將液體吸至1.5mL離心管中室溫靜置3～5min，然后加入0.2mL氯仿輕輕振搖15s，室溫靜置2～3min后4℃12 000rpm／min離心15min，取上清無(wú)色水相（0.5～0.6mL）吸到EP管中（DEPC處理過(guò)）加入0.5mL異丙醇，室溫下靜置10min。4℃12 000rpm／min離心10min，觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清液，加入75%的乙醇1mL洗滌（DEPC水新配制），4℃7 500rpm／min離心5 min，重復(fù)該操作2次。棄上清液用小Tip吸干液體，空氣中金屬浴55～60℃干燥沉淀5～10min，加入20～30uL DEPC處理水，用槍吹打均勻溶解總RNA。將上述得到的RNA在核酸蛋白分析儀上檢測(cè)260／280的OD值。將所提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4 樣品OPG、RANKL、OC 和β－actin的熒光定量測(cè)定 引物序列由上海生工生物試劑有限公司合成，用熒光定量PCR儀進(jìn)行RT－PCR反映。RTPCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性10s，58℃退火10s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72℃退火10 s，結(jié)束時(shí)采集熒光；反應(yīng)完成后從55～95℃緩慢升溫，每個(gè)循環(huán)上升0.5℃，整個(gè)過(guò)程進(jìn)行連續(xù)采集熒光，產(chǎn)生融解曲線，每組5個(gè)平行。以β－actin為內(nèi)參基因，通過(guò)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)含1%RA的磷硅酸鈣骨水泥浸提液和15%MCP＋0.5%RA的骨水泥浸提液進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，按照構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果以目的基因OPG、RANKL、OC和β－actin拷貝數(shù)的比值為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。為分析不同分離株OPG、RANKL和OC基因表達(dá)量的差異，不加浸提液的成骨細(xì)胞為陰性，根據(jù)公式計(jì)算一個(gè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平在不同cDNA樣品中相差的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，1%RA骨水泥和含15%MCP＋0.5%RA骨水泥與對(duì)照組組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

用核酸蛋白分析儀檢測(cè)提取總RNA的260／280的OD值和RNA濃度，OD值均為1.8～2.0之間，證明所提取的RNA純度較高，滿足試驗(yàn)要求，可以進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)RNA濃度進(jìn)行定量，濃度均調(diào)整為80ng／uL。

2.2 OPG、RANKL和OC表達(dá)分析

15%MCP＋0.5%RA骨水泥浸提液和1%RA的骨水泥浸提液與空白對(duì)照組OPG、RANKL和OC基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異（見(jiàn)表1）。含1%RA的磷硅酸鈣骨水泥浸提液具有促進(jìn)OPG、OC2個(gè)基因表達(dá)的作用，降低RANKL表達(dá)的作用（見(jiàn)圖3）。含0.5%RA和15%MCP的磷硅酸鈣骨水泥浸提液對(duì)OPG、OC2個(gè)基因具有促進(jìn)表達(dá)的作用，對(duì)RANKL的表達(dá)作用不明顯（見(jiàn)圖4）。含有15%MCP的0.5%RA的骨水泥對(duì)成骨細(xì)胞OPG和OC的促進(jìn)表達(dá)作用強(qiáng)于1%RA骨水泥，MCP能加速骨水泥的凝固，在浸提液制作過(guò)程中骨水泥顆粒不易浸出，含有RA的骨水泥藥物釋放過(guò)程中，骨水泥顆粒會(huì)浸出，由于本實(shí)驗(yàn)骨水泥材料為納米級(jí)，可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表1 骨水泥浸提液與空白對(duì)照組成骨細(xì)胞中OPG、RANKL和OC基因的差異表達(dá)

圖3 1%RA骨水泥浸提液成骨細(xì)胞OPG、RANKL和OC基因mRNA差異表達(dá)

3 討論

在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、活化的多種細(xì)胞因子中，OPG通過(guò)阻斷RANKL的功能，抑制破骨細(xì)胞的分化及活化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。RANKL的前體是RANK，RANKL被認(rèn)為是介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和活化的關(guān)鍵因子，它能刺激破骨細(xì)胞的分化、活化，抑制破骨細(xì)胞凋亡，與OPG形成2個(gè)對(duì)立競(jìng)爭(zhēng)的因子，破骨細(xì)胞的成熟及功能狀態(tài)可通過(guò)OPG與RANKL 的比值決定［8］。

圖4 15%MCP＋0.5%RA骨水泥浸提液成骨細(xì)胞OPG、RANKL和OC基因的mRNA差異表達(dá)

OC 屬于 γ－羧谷氨酸包含蛋白類（GLA proteins），是維生素K依賴性蛋白類，在骨礦化峰期之后該蛋白開(kāi)始積聚，使用維生素K拮抗劑能夠使此蛋白在骨中的含量減少，對(duì)其脯氨酸的含量不產(chǎn)生影響，對(duì)骨的機(jī)械強(qiáng)度也不產(chǎn)生影響。根據(jù)骨鈣素的變化情況鑒別骨質(zhì)疏松的轉(zhuǎn)換類型：老年性骨質(zhì)中骨鈣素升高不明顯屬于低轉(zhuǎn)換型；絕經(jīng)后骨質(zhì)中骨鈣素水平明顯升高屬于高轉(zhuǎn)換型［9］。對(duì)骨中OC表達(dá)進(jìn)行分析，可判定骨中含鈣量的高低，進(jìn)而對(duì)骨質(zhì)疏松的類型進(jìn)行判斷，在研究中具有非常重要的意義［10］。

本試驗(yàn)采用相對(duì)定量的方法，參比β－actin制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，選用1%RA的骨水泥和含15%MCP＋0.5%RA的骨水泥DMEM培養(yǎng)基浸提液，浸提液與正常的DMEM培養(yǎng)基的比例為1∶7作為培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，由于此比例對(duì)細(xì)胞具有弱毒性，培養(yǎng)3d后提取剩余60%～70%左右細(xì)胞的總RNA；以這2個(gè)濃度含藥量作為研究OPG、RANKL和OC的培養(yǎng)基，通過(guò)目的基因轉(zhuǎn)錄水平在不同cDNA樣品中相差的倍數(shù)，證實(shí)磷硅酸鈣骨水泥浸提液具有促進(jìn)OPG、OC2個(gè)基因表達(dá)的作用；RA骨水泥具有降低RANKL表達(dá)的作用，添加MCP的RA對(duì)RNAKL表達(dá)作用不明顯；OPG和OC2個(gè)基因?qū)Τ晒羌?xì)胞的增值具有促進(jìn)作用，增加骨鈣含量促進(jìn)骨愈合。RANKL為破骨細(xì)胞標(biāo)志性因子，骨水泥浸提液對(duì)破骨細(xì)胞生成具有抑制作用，說(shuō)明RA對(duì)成骨細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用［11，12］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子水平進(jìn)行添加不同藥物的磷硅酸鹽骨水泥相關(guān)基因表達(dá)量的分析，闡述所研究材料在基因方面對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的相關(guān)性，含RA的磷硅酸鈣骨水泥可促進(jìn)成骨細(xì)胞形成分化，抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)成骨細(xì)胞分化生長(zhǎng)和骨愈合具有一定的促進(jìn)作用，為臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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