周珍 郭艷麗 韓立杰,2 郭煒 李書梅 沈素朋 董稚明

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011；

2.河北省滄州市中心醫(yī)院放療科，河北 滄州 061001；

3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病案室，河北 石家莊 050011

食管鱗癌中CAV-1基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)

周珍1 郭艷麗1 韓立杰1,2 郭煒1 李書梅3 沈素朋1 董稚明1

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011；

2.河北省滄州市中心醫(yī)院放療科，河北 滄州 061001；

3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病案室，河北 石家莊 050011

背景與目的：作為重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一，DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。研究表明腫瘤細(xì)胞基因組正常DNA甲基化模式異常改變所導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)基因功能異?？赡軈⑴c腫瘤發(fā)生與發(fā)展。本研究通過(guò)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinomas，ESCC)組織中質(zhì)膜微囊蛋白-1(caveolin-1，CAV-1)基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)，探討CAV-1基因在食管鱗癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。方法：分別應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR法、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)食管癌及相應(yīng)癌旁正常黏膜組織標(biāo)本中CAV-1基因甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：CAV-1 mRNA在食管癌和癌旁正常組織中的表達(dá)量分別為0.86±0.56和0.40±0.36，食管癌組織中CAV-1 mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CAV-1 mRNA表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)；食管鱗癌組織中，CAV-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為66.7%(34/51)；顯著高于正常食管黏膜組織(15.7%，8/51)(P＜0.01)。CAV-1蛋白表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤的臨床分期和分化程度無(wú)關(guān)(P＞0.05)。51例食管癌組織中1例發(fā)生了基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，甲基化率為2.0%(1/51)；而相應(yīng)癌旁正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn)有該基因的甲基化現(xiàn)象。食管癌組織中該基因的甲基化率與相應(yīng)癌旁正常組織相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：CAV-1基因在食管鱗癌組織中mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常黏膜組織，該基因的高表達(dá)對(duì)于腫瘤的發(fā)生及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移起到了一定的促進(jìn)作用；癌及癌旁組織中該基因的表達(dá)異常均與該基因的甲基化狀態(tài)無(wú)關(guān)。

食管磷癌；甲基化；CAV-1基因；表達(dá)

食管癌的發(fā)生具有多階段、多因素的特征。在癌變過(guò)程中，涉及抑癌基因或癌基因的表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞傳導(dǎo)通路的活化或抑制等改變。細(xì)胞質(zhì)膜微囊(caveolae)直徑為50～100 nm、是存在于細(xì)胞膜上的許多燒瓶樣的小凹結(jié)構(gòu)。它主要存在或定位于細(xì)胞質(zhì)膜附近，是各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和信號(hào)分子的“整合器”，在囊泡運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和腫瘤抑制中起重要作用。質(zhì)膜微囊蛋白-1(caveolin-1，CAV-1)是細(xì)胞質(zhì)膜微囊的關(guān)鍵蛋白，是維持其結(jié)構(gòu)和功能的重要物質(zhì)，并在功能上調(diào)控這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化狀態(tài)，參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，從而使之更加的準(zhǔn)確、有效、迅速。CAV-1具有腳手架結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)著N端82～101氨基酸殘基，在原位和體外能結(jié)合和抑制多種信使蛋白，這些信號(hào)分子的激活常導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，CAV-1通過(guò)與這些信號(hào)分子結(jié)合而使它們失活［1］。研究表明CAV-1參與細(xì)胞的內(nèi)吞、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等；本研究檢測(cè)了食管鱗癌中CAV-1基因的甲基化狀態(tài)及其mRNA及蛋白表達(dá)情況，旨在了解食管鱗癌中CAV-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)對(duì)其mRNA及蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

蛋白酶K(購(gòu)自德國(guó)Merck公司)、氫醌(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；亞硫酸氫鈉(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)、 WizardDNA 純化試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)、TRIzol(購(gòu)自美國(guó)Invit ro2gen)，所有引物均在北京賽百勝公司合成；兔抗人CAV-1多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)；免疫組化染色采用的即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2 研究對(duì)象和標(biāo)本來(lái)源

組織標(biāo)本均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2008—2011年間的食管癌手術(shù)患者，共51例。其中男性37例，女性14 例，年齡45～74歲，平均年齡59.3歲。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及相應(yīng)癌旁正常黏膜組織，全部患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。手術(shù)切除標(biāo)本一部分在新鮮狀態(tài)下放入液氮冷藏，后轉(zhuǎn)到-80 ℃低溫冰箱保存以提取DNA及RNA，一部分標(biāo)本用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)制作蠟塊保存，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。HE染色經(jīng)常規(guī)病理診斷證實(shí)癌組織均為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織均為正常食管鱗狀上皮。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，51例腫瘤患者中Ⅰ期0例(0%)，Ⅱ期40例(78.4%)，Ⅲ期10例(19.6%)，Ⅳ期1例(2.0%)。腫瘤組織學(xué)分級(jí)為：高分化16例(31.4%)，中分化5例(9.8%)，低分化30例(58.8%)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè)CAV-1 mRNA的表達(dá)

按TRIzol試劑說(shuō)明書提取總RNA(美國(guó)Invitrogen公司)，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A3500，美國(guó)Promega公司)說(shuō)明書的比例加樣，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。GAPDH作為內(nèi)參照，引物及退火溫度見表1。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel work22 ID軟件，對(duì)電泳圖像中CAV-1的表達(dá)進(jìn)行半定量。以CAV-1條帶的光密度值與GAPDH條帶的光密度值的比值作為CAV-1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CAV-1蛋白表達(dá)

4～5 μm的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%甲醇過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，采用pH=9.0的EDTA緩沖液進(jìn)行高壓鍋抗原熱修復(fù)2 min。依次加入一抗(兔抗人CAV-1多克隆抗體)工作液按1∶100稀釋及相應(yīng)生物素化二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。PBS取代一抗作為空白對(duì)照，其余步驟同上。利用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 甲基化特異性PCR(MSP)［2］方法

酚/氯仿抽提法提取癌組織和癌旁正常組織基因組DNA。每個(gè)樣本取1～10 μg DNA用3 mol/L NaOH變性處理，于10 mmol/L氫醌和3 mmol/L亞硫酸氫鈉中50 ℃水浴，至完全溶解。然后，用Wizard DNA純化試劑盒純化經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而基因的CpG島發(fā)生甲基化后，則不能發(fā)生這種改變，根據(jù)此原理設(shè)計(jì)相應(yīng)的甲基化和非甲基化引物，檢測(cè)該基因是否發(fā)生甲基化。具體引物序列及退火溫度見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用UV凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。MSP陽(yáng)性對(duì)照采用正常人血有核細(xì)胞基因組DNA經(jīng)甲基化酶(Sss Ⅰ)處理以后進(jìn)行PCR，陰性對(duì)照用滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR。為進(jìn)行MSP檢測(cè)的質(zhì)量控制，隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間的差異用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用Spearman分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 食管癌中CAV-1 mRNA表達(dá)

檢測(cè)51例食管鱗癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中CAV-1 mRNA表達(dá)情況(圖1)。CAV-1 mRNA在食管癌和癌旁正常組織中的表達(dá)量分別為0.86±0.56和0.40±0.36，食管癌組織中CAV-1 mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，2者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在食管鱗癌患者中，CAV-1 mRNA表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤的組織分化程度，年齡和性別無(wú)關(guān)(P＞0.05，表2)。

圖1 食管鱗癌組織中CAV-1的表達(dá)Fig. 1 mRNA analysis of CAV-1 gene and GAPDH in ESCC tissues

表1 RT-PCR及MSP引物序列及反應(yīng)條件Tab. 1 The primer sequence and reaction condition of RT-PCR and MSP

表2 食管鱗癌組織中CAV-1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 The correlation of mRNA expression of CAV-1 and ESCC clinical pathological characteristic

2.2 食管癌中CAV-1 蛋白表達(dá)

CAV-1 蛋白免疫組化染色為細(xì)胞質(zhì)著色(圖2)。51例食管鱗癌組織中，34例CAV-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(34/51)，正常食管黏膜組織中8例CAV-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為15.7%(8/51)，食管癌組織CAV-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常食管黏膜組織中CAV-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(P＜0.01)在食管鱗癌中，CAV-1蛋白表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤臨床分期和組織分化程度無(wú)關(guān)(P＞0.05，表3)。

表3 食管鱗癌組織中CAV-1蛋白表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性Tab. 3 The correlation of protein expression of CAV-1 and ESCC clinical pathological characteristic

2.3 食管鱗癌中CAV-1基因甲基化狀態(tài)

經(jīng)UCSC序列檢索發(fā)現(xiàn)CAV-1基因在橫跨部分啟動(dòng)子及第一外顯子的近300 bp范圍內(nèi)富含CG二核苷酸序列，且密度高達(dá)20%以上(圖3)，推測(cè)CAV-1基因在癌組織中的表達(dá)改變可能與基因CpG島甲基化有關(guān)。進(jìn)一步利用MSP的方法，設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)了MSP區(qū)域(-152至+49)位點(diǎn)的甲基化狀況。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)51例食管癌組織中，僅有1例擴(kuò)增出了甲基化條帶，甲基化率為2.0% (1/51)；而相應(yīng)正常黏膜組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象；食管癌組織甲基化率與相應(yīng)癌旁正常組織相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 食管鱗癌及相應(yīng)癌旁組織中CAV-1蛋白的表達(dá)Fig. 2 Protein analysis of CAV-1 gene in ESCC and corresponding adjacent non-cancerous tissues (EliVision, ×400)

圖3 CAV-1基因的CpG島分布Fig. 3 CAV-1 CpG island prediction results

3 討 論

CAV-1基因位于人染色體7q31.1，相對(duì)分子質(zhì)量為21×103～240×103，全長(zhǎng)37 392 bp，含3個(gè)外顯子；其mRNA全長(zhǎng)2 723 bp，編碼1個(gè)含178氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。CAV-1是細(xì)胞質(zhì)膜微囊的主要成分。Caveolins家族包括3種亞型：CAV-1，CAV-2和CAV-3。其中CAV-1有α和β 2種亞型，它們參與細(xì)胞的微囊形成、微囊的轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。大量研究表明CAV-1與腫瘤發(fā)生緊密相關(guān)，CAV-1是維持微囊結(jié)構(gòu)和功能的重要物質(zhì)，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，CAV-1抑制惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，因雜合性缺失、突變和過(guò)甲基化等原因，CAV-1在卵巢癌［4］、乳腺癌［5］、肉瘤［6］等腫瘤中表達(dá)下調(diào)。但是，另外的一些研究結(jié)果卻與此相反。有研究報(bào)道，CAV-1在結(jié)腸腺癌［7］、胰腺癌［8］中可能具有促腫瘤生成作用。Yang等［9］的研究已經(jīng)證實(shí)并記錄了CAV-1在老鼠和人類的前列腺癌細(xì)胞中是過(guò)表達(dá)的。這可能與酪氨酸磷酸化，絲氨酸磷酸化和P132L基因點(diǎn)突變這3種不同的機(jī)制使CAV-1腫瘤抑制作用失活有關(guān)［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，CAV-1基因在食管鱗癌中mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常黏膜組織，該基因的高表達(dá)對(duì)于腫瘤的發(fā)生及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移起到了一定的促進(jìn)作用。因此，CAV-1在某些腫瘤中起著抑制腫瘤的作用，而在另一些腫瘤中反而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，它發(fā)揮的作用可能與腫瘤組織類型的不同有關(guān)。而且從癌及癌旁組織的研究中我們發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)異常均與該基因的甲基化狀態(tài)無(wú)關(guān)。這可能與我們?cè)谘芯恐袑?duì)甲基化的位點(diǎn)選擇局限有關(guān)。

總之，我們的研究結(jié)果表明CAV-1的甲基化狀態(tài)可能與食管癌無(wú)關(guān)，而其在食管癌中表達(dá)較正常食管黏膜升高，提示CAV-1基因?qū)κ彻馨┑陌l(fā)生、發(fā)展可能有促進(jìn)作用，并且CAV-1基因在食管癌中表達(dá)的升高可能預(yù)示著食管癌患者的不良預(yù)后，這對(duì)食管癌的早期預(yù)防和診斷及判斷預(yù)后具有重要意義。

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Expression and methylation status of CAV-1 gene in esophageal squamous cell carcinoma

ZHOU Zhen1, GUO Yan-li1, HAN Li-jie1,2, GUO Wei1, LI Shu-mei3, SHEN Su-peng1, DONG Zhi-ming1
(1.Laboratory of Pathology, Hebei Cancer Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China; 2. Department of Radiotherapy, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou Hebei 061001, China; 3. Department of Medical Records, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

DONG Zhi-ming E-mail: dongzhiming2000@163.com

Background and purpose: As one of the important epigenetic phenomena, DNA methylation plays an important regulatory function for the expression of genes. Study shows that abnormal changes of DNA methylation patterns of normal tumor cell genome leads to dysfunction of cancer related gene, and this may be associated with tumor occurrence and development. The study investigated the promoter methylation and expression of caveolin-1 (CAV-1) gene in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), and to elucidate its role in ESCC. Methods: We used MSP approach, RT-PCR, and immunohistochemistry method respectively to examine the methylation status of the 5’CpG island of CAV-1 gene and its expression at mRNA and protein levels in tumors and corresponding normal tissues. Results: CAV-1 mRNA expression in tumor tissues (0.86±0.56) was signi fi cantly higher than that in corresponding normal tissues (0.40±0.36, P＜0.05). The mRNA expression of CAV-1 was correlated with status of lymphatic metastasisand TNM stage of ESCC patients (P＜0.05). The protein expression of CAV-1 in tumor specimens (66.7%, 34/51) was signi fi cantly higher than that in corresponding normal tissues (15.7%, 8/51, P＜0.01). The protein expression of CAV-1 was signi fi cantly associated with lymphatic metastasis of ESCC (P＜0.05), however, it was not associated with differentiation and TNM stage (P＞0.05). The promoter methylation frequency of CAV-1 in tumor specimens was 2.0% (1/51), and the methylation phenomenon has not been found in corresponding normal tissues. The promoter methylation frequency of CAV-1 in tumor specimens showed no signi fi cant difference compared with the corresponding normal tissues (P＞0.05). Conclusion: The mRNA and protein expression of CAV-1 in tumor specimens was signi fi cantly higher than that in corresponding normal tissues. Aberrant high expression of CAV-1 has played a certain role in promoting tumorigenesis and lymph node metastasis. The expression both in ESCC and corresponding normal tissues has no correlation with the promoter methylation status.

Esophageal squamous cell carcinoma; Methylation; CAV-1 gene; Expression

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.013

R735.1

A

1007-3639(2014)10-0789-05

2014-07-15

2014-08-12）

河北省醫(yī)學(xué)研究重大專項(xiàng)基金資助(NO: 冀財(cái)預(yù)復(fù)［2012］2056號(hào))。

董稚明 E-mail:dongzhiming2000@163.com