復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學乳腺研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

mTOR信號通路介導產生XCL1可促進乳腺癌耐藥細胞株的增殖

白玉盤 楊小利 歐周羅

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學乳腺研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

背景與目的：統(tǒng)計表明90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關，而在乳腺癌中常見PI3K/Akt/ mTOR信號通路的異常激活，以此通路為靶點的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點。本研究主要分析C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1，XCL1)對乳腺癌耐藥細胞增殖的影響及其產生機制。方法：建立吉西他濱耐藥性人乳腺癌細胞系MDA-MB-231/Gem。采用CCK8檢測MDA-MB-231和MDA-MB-231/Gem的增殖能力，RT-PCR、ELISA檢測2株細胞株XCL1表達差異，Western blot檢測mTOR的表達。結果：與MDA-MB-231相比，MDA-MB-231/ Gem的增殖能力增強，XCL1在耐藥細胞株表達增強。mTOR在耐藥細胞株表達水平及磷酸化水平增強。在MDAMB-231中加入外源性XCL1 24 h后，細胞增殖能力增強。而在MDA-MB-231/Gem中加入抗XCL1抗體后，細胞增殖能力降低。mTOR抑制劑處理MDA-MB-231/Gem后，細胞增殖能力降低，XCL1產生減少。結論：趨化因子XCL1的分泌可促進乳腺癌耐藥細胞的增殖并由mTOR信號通路介導產生。

MDA-MB-231/Gem；趨化因子配基1；mTOR；乳腺癌

惡性腫瘤已成為人類的第一殺手，嚴重危害人類的生命健康。今后20年內全球癌癥患者人數還將快速上升。目前，化療是治療腫瘤的主要途徑之一，然而腫瘤耐藥往往造成化療失敗，從而導致患者病情惡化甚至死亡［1-2］。統(tǒng)計數據表明，90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關。因此，如何克服腫瘤耐藥是成功治療惡性腫瘤急需解決的關鍵問題之一［3］。哺乳動物體內的mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可介導多種蛋白如HIF-1α等的產生。mTOR信號通路與人類多種腫瘤密切相關，其在腫瘤細胞的增殖、存活、凋亡、血管發(fā)生和轉移以及對放化療抵抗中發(fā)揮重要作用［4-5］，乳腺癌中常見PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活，以此通路為靶點的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點［5-6］。本研究應用CCK8、PCR及Western blot等多種實驗方法檢測了乳腺癌細胞和耐藥細胞株中C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1，XCL1)、mTOR的表達，并分析其與細胞增殖的關系及耐藥機制，旨在為乳腺癌臨床治療提供新的靶點和理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞及試劑

1.1.1 細胞

化療抵抗乳腺癌細胞系MDA-MB-231/ Gemcitabine(MDA-MB-231/Gem)由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所建立。MDA-MB-231及MDA-MB-231/Gem細胞用DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%FBS。細胞傳代時用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.1.2 主要試劑

重組蛋白XCL1(購自美國R&D公司)，mTOR和磷酸化mTOR抗體及mTOR磷酸化抑制劑(購自美國Cell Signaling Technology公司)，ELISA試劑盒(購自美國R&D公司)，RIPA裂解液(購自中國碧云天公司)，PhosStop(購自瑞士Roche公司)，BCA蛋白定量試劑盒(購自美國Thermo Scientific Pierce公司)，TRIzol(購自美國Invitrogen公司)，凋亡試劑盒(購自美國Invitrogen公司)。

1. 2 主要儀器

Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(購自德國Eppendorf公司)，精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱(購自上海精宏實驗設備有限公司)，恒溫金屬浴振蕩器(購自中國博日科技Bioer公司)，Bio-Rad恒流恒壓電泳儀(購自美國Bio-Rad公司)，ATTO AE-6450電泳槽(購自日本ATTO公司)，UV-120-02型紫外分光光度儀(購自日本島津公司)，Image quant Las 4000mini凝膠成像儀及Nanoview微量檢測儀(購自美國通用電氣)，ESCO classⅡ生物安全柜(購自新加坡ESCO公司)， Biotek ELX-800酶標儀(購自美國Biotek公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞總RNA的抽提

將細胞培養(yǎng)基棄去，用預冷的PBS洗1次，加入1 mL TRIzol(以能完全覆蓋整個細胞表面為宜)，反復吹打細胞然后轉移到1.5 mL Eppendorf管(EP管)內，將EP管放入冰盒里靜置5 min后，加入200 μL氯仿，振蕩15 s后，置于冰盒內靜置2 min，隨后12 000×g、4 ℃離心15 min，將上清液轉移至新的EP管內，并加入500 μL異丙醇，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，靜置10 min，行12 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液。接著，加入1 mL 體積分數為75%乙醇(用DEPC水配制)，輕輕洗滌沉淀，行7 500×g、4 ℃離心5 min，棄上清液，沉淀總RNA置室溫風干5 min，隨后加入100 μL的DEPC水溶解。最后，用多功能酶標儀測定RNA濃度，按照反應體系需要，加入各種試劑，放入金屬浴內反應，去除其中的DNA酶。

1.3.2 RT-PCR反應及產物鑒定

1.3.2.1 逆轉錄反應

反應體系總體積為20 μL，模板為從乳腺癌細胞抽提的總RNA。在EP管中分別加入試劑：4 μL 5×PrimeScriptBuffer PrimeScript，1 μL RT Enzyme Mix Ⅰ，1 μL Oligo dT Primer，1 μL Random 6 mers，2 μL RNA，11 μL DEPC H2O，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，置于PCR儀(EppendofMastercycler pro S)內，根據相應的反應條件，進行cDNA合成。

反轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.3.2.2 PCR反應

反應體系總體積為20 μL。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物XCL1序列正義鏈：5’-GCTCTCTCACTGCATACATTGT-3’；反義鏈：5’-AGTCACAGCTGTATTGGTCG-3’。在EP管中分別加入各種反應試劑：2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTP Mix，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，2 μL cDNA，14.5 μL H2O，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，置于PCR儀內，并根據相應的反應條件，進行PCR反應。

1.3.2.3 產物驗證

取1.5 g瓊脂糖，加入1×TAE緩沖液150 mL，置于微波爐(Galanz)內加熱至完全溶解，倒入裝有梳子的電泳模具中凝固，制備成1%瓊脂糖凝膠。然后，把凝膠放入電泳槽(Biorad)內，加入1×TE電泳緩沖液，取5 μL的擴增產物，加入1 μL的6×Loading Buffer，與DNA marker一起進行瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓，30 min電泳。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于EB染色液中染色10 min，之后在清水內清洗10 min，最后利用生物電泳圖像分析系統(tǒng)(復日科技，FR-980A)觀察并拍照，確認特異性目的條帶。

1.3.3 蛋白免疫印跡雜交

取對數生長期細胞用預冷的PBS清洗3遍后，在培養(yǎng)皿中加入適量PBS液，用細胞刮刀收集細胞轉入EP管中。然后，200×g，離心半徑140 mm離心5 min，棄上清液，細胞沉淀中加入適量細胞裂解液混合均勻，冰上放置10 min，使其充分裂解。接著12 000×g，4 ℃離心5 min，將上清液轉入新的EP管中，抽提的總蛋白用BCA法測定濃度，以2 000 μg/mL為標準，稀釋各個樣品，按照40 μg/孔上樣，即每孔的上樣量為20 μL的蛋白和5 μL的5×蛋白Loading Buffer。95 ℃加熱煮沸5 min，使蛋白變性，12 000×g離心1 min。制備12%分離膠(30%聚丙烯酰胺，pH=8.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED)和濃縮膠(30%聚丙烯酰胺，pH=6.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED)，放入蛋白電泳槽(Bio-rad)中，加入電泳緩沖液(25 mmol/L Tris，250 mmol/ L 甘氨酸，0.1%SDS)。上樣，接通電源，濃縮膠在80 V電壓條件下，分離膠在120 V電壓條件下進行電泳，1.5 h后結束電泳。加入轉膜緩沖液，并放入冰袋，整體置于冰盒內，接通電源，在90 V電壓下轉膜2 h。隨后將PVDF膜浸于5%的牛奶中，封閉1 h。根據蛋白marker裁剪PVDF膜，加入用一抗稀釋液稀釋的抗體，4 ℃搖床溫育過夜。隔日，用TBST洗膜3次，每次10 min。室溫溫育二抗1 h，隨后用TBST洗膜3次，每次10 min。最后，化學發(fā)光法顯色。按照SuperSignal West Dura Extended Duration Substrated的產品說明書配制顯色液，加到PVDF膜上，用ImageQuant Las 4000 mini凝膠成像儀檢測特異性條帶。

1.3.4 細胞增殖實驗

將細胞分別以每孔3 000個細胞的密度接種于96孔板，每個時間點做5個平行樣本，將培養(yǎng)板在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養(yǎng)。分別在0、1、2、3、4、5、6 d上述指定時間向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內溫育2 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，計算每5孔的吸光度值的平均值和標準差，繪制細胞生長曲線。

1.3.5 細胞凋亡檢測

細胞以每孔2×105密度接種于6孔培養(yǎng)板，將細胞在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養(yǎng)24 h后，給予吉西他濱35 μmol/L處理48 h，胰酶消化收集細胞(培養(yǎng)基上清液一起收集)，200×g，離心半徑140 mm，離心5 min。然后細胞用預冷的PBS洗2遍。用1倍結合緩沖液重懸細胞，調節(jié)細胞濃度到1×106/mL。接著，加入5 μL AnnexinV-FITC及1 μL 100 μg/mL的PI工作液，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。最后，加入1倍結合緩沖液400 μL，輕輕混勻，用流式細胞檢測儀器(貝克曼)檢測細胞凋亡。CXP 2.1軟件分析各個實相的細胞，至少50 000個細胞被檢測。

1.3.6 ELISA實驗

分別將標本或不同濃度標準品(0 pg/mL孔加試劑稀釋液)加入相應孔中(100 μL/孔)用封板膠紙封住反應孔，37 ℃溫育90 min。提前準備好抗體工作液，洗板5次，除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃溫育60 min。提前制備酶結合物工作液，室溫避光放置。洗板5次，除空白孔外加入酶結合物液(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃溫育30 min。洗板5次。加入顯色底物(包括空白孔)100 μL/孔，37 ℃避光溫育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測量A450值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 耐藥細胞株231/Gem的鑒定及特性

將231和相應的231/Gem細胞按2×105接種于6孔板，并在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給予吉西他濱35 μmol/L處理，72 h后進行凋亡檢測，發(fā)現231/Gem細胞的凋亡率明顯下降，比231細胞下降了28.8%，說明231/Gem耐藥性穩(wěn)定(圖 1A)。利用CCK8進行細胞增殖檢測發(fā)現，與231細胞相比，231/Gem從第4天開始增殖明顯加快即隨著時間的推移其增殖能力明顯增強(圖1B)。

2.2 耐藥細胞株231/Gem的增殖特性與XCL1的分泌增加相關

圖1 與231相比，231/Gem細胞凋亡減少(A)，隨時間變化增殖能力明顯增強(B)Fig. 1 Apoptosis of 231/Gem was reduced(A) the proliferation of 231/Gem signi fi cantly enhanced over time compare with 231(B)

本實驗中，為研究趨化因子與吉西他濱耐藥的關系，從親本細胞231與建立的吉西他濱耐藥細胞株231/Gem提取RNA，對趨化因子家族C、CC、CXC、CX3C的代表性趨化因子進行PCR檢測，結果發(fā)現，與親本乳腺癌細胞相比，231/Gem細胞株中趨化因子XCL1 mRNA表達水平增高，而其他趨化因子未見分泌增加(圖2AB)。ELISA實驗證實乳腺癌耐藥細胞株中XCL1蛋白水平顯著增高(圖2C)。為了驗證231/Gem的增殖能力與XCL1相關，我們在親本231細胞株中加入外源性XCL1的重組蛋白，在231/Gem 細胞株中加入抗XCL1的抗體，24 h后發(fā)現培液中含XCL1細胞因子的231細胞株增殖能力增強(圖2D)。而加入抗XCL1抗體的耐藥細胞較231/Gem增殖速度減低(圖3A)。這些結果提示，耐藥細胞株增殖能力與XCL1的分泌增加相關。

2.3 mTOR信號通路的激活促進XCL1的分泌

Western檢測發(fā)現，在耐藥細胞株中mTOR總蛋白表達水平、mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均比對照組顯著增強(圖3B)，提示耐藥細胞株中mTOR信號通路的激活可能與XCL1的分泌增加相關，為了驗證這一設想，我們在耐藥細胞株中加入mTOR的磷酸化抑制劑(100 nmol/L)——雷帕霉素(Rapamycin)，其能抑制mTOR的磷酸化，進而抑制下游效應分子70-KDaS6激酶(P70S6K)的活性，與我們猜測相同的是，耐藥細胞株中mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均被抑制(圖3C)ELASIA實驗證實耐藥細胞XCL1分泌下降(圖3D)。這些結果提示mTOR信號通路的磷酸化促使XCL1的分泌增多，從而使耐藥細胞株的增殖能力增強。

圖2 與231相比，231/Gem中XCL1 mRNA表達(A，B)和蛋白質水平(C)均升高，231中加重組XCL1可促細胞增殖(D)Fig. 2 Comparad to 231, mRNA expression(A, B) and protein level(C) of XCL1 in 231/Gem increased. Recombinant XCL1 promoted 231 proliferation (D)

圖3 231/Gem中加入抗XCL1抗體可拆抑制細胞增值(A)，231/Gem中mTOR及磷酸化P70S6K水平升高(B)，mTOR抑制劑rapamycin可逆轉之(C)，伴XCL1下調(D)Fig. 3 Anti-XCL1 reduced 231/Gem proliferation(A). mTOR and p-P70S6K were higher in 231/Gem(B), mTOR inhibitor rapamycin can invert them(C), and down-regulate XCL1(D)

3 討 論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近10年來，中國主要城市乳腺癌發(fā)病率增加了37%，全國則以3%～4%的水平呈逐年上升趨勢［7］。但是，乳腺癌治療中存在的耐藥問題大大影響了化療藥物的臨床療效，是導致乳腺癌臨床治療失敗的主要原因之一。因此針對這些問題，我們選用業(yè)已建立的耐吉西他濱的乳腺癌細胞株和親本細胞株作為研究對象，探討乳腺癌耐藥細胞株的增殖特性及其相關的機制。

我們的實驗結果顯示與親本乳腺癌細胞株相比，乳腺癌耐吉西他濱細胞株的增殖能力明顯增強，這一現象與趨化因子XCL1的表達密不可分。趨化因子是能引起細胞定向遷移的細胞因子，對機體的免疫系統(tǒng)非常重要［8］。XCL1亦稱Lymphotactin(Ltn)是C族趨化因子家族的一員，其受體XCR1與XCL1相互作用參與抗原呈遞、激活T淋巴細胞和NK細胞，發(fā)揮機體的細胞免疫功能，能夠調節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，增強黏膜免疫、抗腫瘤免疫，在感染性疾病過程中誘發(fā)炎性反應等［8-10］。本次實驗首次發(fā)現XCL1可以促進腫瘤細胞尤其是耐藥細胞株的增殖，在乳腺癌耐藥細胞株中，我們檢測到XCL1的表達顯著增高，給予XCL1抗體后耐藥細胞株的增殖能力明顯下降，說明耐藥細胞株中XCL1的上調導致其增殖能力增強。

TOR基因是 1991年在酵母中作為雷帕霉素的靶蛋白而被發(fā)現的，與酵母 TOR結構和功能相應的哺乳動物的TOR稱為mTOR。mTOR被認為是磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶蛋白質家族成員［11］，它的主要功能是調控蛋白質的合成，調節(jié)細胞的生長和增殖［12］。mTOR激酶主要通過2種信號通路調控細胞的生長和增殖：①PI3K/Akt /mTOR通路，Akt可直接磷酸化mTOR的Ser 2448位點，激活mTOR和下游途徑，控制細胞增殖和轉化所需的特殊蛋白質的翻譯［13］。②Akt/TSC1-TSC2/mTOR/S6K通路，結節(jié)性腦硬化復合物(TSC)是腫瘤抑制因子，當基因發(fā)生突變或缺失時引起細胞黏附、生長和遷移，可導致大腦及腎臟的結節(jié)性硬化性損壞。在哺乳動物細胞中，TSC1-TSC2復合物是mTOR的抑制因子，因此在TSC1-TSC2復合物異常的細胞中，mTOR及下游的效應分子被激活，使細胞無限增殖［12-14］。mTOR的激活可以參與體內多條信號通路，影響轉錄及蛋白質合成。本實驗中我們檢測到耐藥細胞株中mTOR及其活性形式p-mTOR表達增高，推測可能是mTOR信號通路的激活促使耐藥細胞株中分泌XCL1增多，從而促進耐藥細胞株的增殖。在耐藥細胞株中加入mTOR抑制劑后，觀察到XCL1的表達顯著下降，進一步驗證了我們的推測。

雖然目前對于腫瘤耐藥機制尤其細胞信號轉導通路的認識有限，但有關研究已經或正在為腫瘤治療帶來新的契機。借助腫瘤分子靶向治療，人們已經開始嘗試通過阻斷細胞中某些信號轉導通路來抑制腫瘤的生長、代謝以及腫瘤血管的生成［15-16］。本研究證實mTOR信號轉導通路介導產生XCL1可促進乳腺癌耐藥細胞株的增殖，提示趨化因子參與腫瘤耐藥，這將為乳腺癌臨床治療提供新的吧點。

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XCL1 mediated by activation of mTOR pathway can promote the proliferation of drug-resistant breast cancer cell

BAI Yu-pan, YANG Xiao-li, OU Zhou-luo
(Breast Cancer Institute, Fudan University

Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

OU Zhou-luo E-mail: ouzhouluo@163.com

Background and purpose: More than 90% of cancer patients are incurable because of drug resistance. Activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer, as a target for chemotherapy drugs has become a hot topic of breast cancer treatment. This study aimed to investigate the effect and mechanism of XCL1 on the proliferation of drug-resistant breast cancer cell, whether is related with the mTOR signaling pathway. Methods: Established gemcitabine-resistant breast cancer cell lines (MDA-MB-231/Gem). CCK8 to detect the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-231/Gem, RT-PCR and ELISA to determine the XCL1 expression level of the two cell lines, Western blot to detect the expression of mTOR. Results: Compared with MDA-MB-231, MDA-MB-231/Gem showed an enhanced proliferative capacity. The expression of XCL1 was increased in the resistant cell lines. Both of protein level and phosphorylation level of mTOR increased in drug-resistant cell lines. The MDA-MB-231 added exogenous XCL1 for 24 h, showed an enhanced cell proliferation. Adding anti-XCL1 antibodies in MDA-MB-231/ Gem could reduce cell proliferation and treating MDA-MB-231/Gem with the mTOR inhibitor could also reduce cell proliferation, as well as the XCL1 expression level. Conclusion: XCL1 promotes the proliferation of drug-resistant breast cancer cells mediated by activation of the mTOR pathway.

MDA-MB-231/Gem; C chemokine ligand 1; mTOR; Breast cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.010

R737.9

A

1007-3639(2014)10-0770-07

2014-03-24

2014-05-08）

國家自然科學基金資助項目(No:81172506)；上海市乳腺腫瘤重點實驗室資助項目(No:12DZ2260100)。

歐周羅 E-mail:ouzhouluo@163.com