尹立國(guó)，王金林，張中原，徐興華，龍海成

（1.遵化市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山064200；2.唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063000）

腦創(chuàng)傷后依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)影響的近期觀察

尹立國(guó)1，王金林2，張中原1，徐興華1，龍海成1

（1.遵化市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山064200；2.唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063000）

創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）有較高發(fā)生率，是導(dǎo)致創(chuàng)傷病人傷殘及死亡的主要原因，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。創(chuàng)傷后如何更好保存患者神經(jīng)功能是臨床工作者和基礎(chǔ)研究工作者面臨的重大課題。線粒體和細(xì)胞膜在腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)過(guò)程中揮重要作用，本研究運(yùn)用改進(jìn)的Marmarou方法建立大鼠彌漫性腦損傷模型，以依達(dá)拉奉（Edaravone）和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM－1）進(jìn)行治療干預(yù)，證明其神經(jīng)保護(hù)的重要作用。

1 材料與方法

1.1 腦創(chuàng)傷模型的制備與分組

雄性成年SD大鼠110只（體重300－350g，購(gòu)自北京維通力華公司，清潔級(jí)，自然光照，環(huán)境安靜，溫度適中，大鼠自由進(jìn)食水，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、顱腦創(chuàng)傷組、依達(dá)拉奉治療組（Edaravone組）、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組（GM－1組）、依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組（聯(lián)合治療組）。每組設(shè)傷后1h、6h、24h、48h、72h5個(gè)時(shí)相點(diǎn)。對(duì)照組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)2只大鼠，創(chuàng)傷組和依達(dá)拉奉干預(yù)組、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組、依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組每時(shí)相點(diǎn)5只大鼠。動(dòng)物置乙醚麻醉缸中，以乙醚吸入方式深度麻醉動(dòng)物，麻醉后的大鼠俯臥于落體致傷海綿墊上，70%酒精消毒顱頂部皮膚，沿正中線矢狀切開(kāi)頭皮，剝離骨膜，顯露人字縫與冠狀縫，將一不銹鋼墊固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間將大鼠頭部固定于打擊模型架下的頭部固定裝置中，重450g，直徑18mm的銅柱沿垂直玻璃管于1.2m高度自由落下，撞擊大鼠顱骨頂部的鋼墊，造成大鼠中度彌漫性顱腦損傷。撞擊后即刻移開(kāi)大鼠，以免銅柱反彈造成頭部二次打擊傷。給予顱腦損傷后大鼠，頭皮切口常規(guī)消毒、縫合。對(duì)照組僅給予相同的麻醉處理及沿中線矢狀切開(kāi)頭皮、剝離骨膜、在冠狀縫與人字縫之間粘鋼墊，置致傷海綿墊上，但不行自由落體致傷，而后常規(guī)消毒、縫合切口。各組未到規(guī)定時(shí)相死亡的大鼠予以剔除（創(chuàng)傷組6h時(shí)相點(diǎn)、48h時(shí)相點(diǎn)、依達(dá)拉奉24h時(shí)相點(diǎn)、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組6h時(shí)相點(diǎn)、依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組48h時(shí)相點(diǎn)各一只）。

1.2 給藥方法

Edaravone治療組給予Edaravone 10mg／kg，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組給予單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂10mg／kg。對(duì)照組、顱腦損傷（TBI）組給予等量生理鹽水。注射方法為傷后10 min，尾靜脈注射，每24h注射1次。

1.3 細(xì)胞色素c檢測(cè)

標(biāo)本甲醛固定，石蠟切片，按武漢博士德提供細(xì)胞色素c檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL法）

按Roche公司提供TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

取進(jìn)行免疫組化組大鼠72h時(shí)相點(diǎn)，大鼠進(jìn)行麻醉處死前進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)Rancan等［1］設(shè)計(jì)的3種感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試方法來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物DBI后神經(jīng)生理功能的缺陷程度，每項(xiàng)重復(fù)3次，滿分24分。

1.6 陽(yáng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)弱結(jié)果分析

采用Motic Med 6.0計(jì)算機(jī)真彩色圖象分析系統(tǒng)以平均光密度進(jìn)行半定量分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，多組間同一時(shí)間點(diǎn)及同一組中不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷組Ctyc免疫反應(yīng)在傷后6h即升高，傷后24h達(dá)高峰，以后迅速下降，Edaravone治療組、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組、依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療組與創(chuàng)傷組比較明顯降低，在24h、48h、72h差異顯著（P＜0.01，表1）。

2.2 傷后1小時(shí)即可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，以后凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，并于48h達(dá)高峰，Edaravone、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂、依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂明顯降低腦創(chuàng)傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，與創(chuàng)傷組比較在24h、48h、72h有顯著性差異（P＜0.01，表2）。

2.3 Edaravone、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂及依達(dá)拉奉聯(lián)合單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂干預(yù)后，DBI后72h大鼠的神經(jīng)生理功能的缺陷程度明顯改善（P＜0.01，表3）。）

表1 大腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)cyt－c表達(dá)動(dòng)態(tài)變化（ˉx±s）

表2 大鼠腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)神經(jīng)凋亡數(shù)的動(dòng)態(tài)變化（ˉx±s）

表3 腦創(chuàng)傷后3天各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較（ˉx±s，n＝22

3 討論

機(jī)體在生理狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生與清除間保持著動(dòng)態(tài)平衡［2－4］。腦創(chuàng)傷后，線粒體在導(dǎo)致組織損傷的分子事件中作用至關(guān)重要［5］。由于顱內(nèi)壓增高，血管痙攣及呼吸紊亂等，產(chǎn)生能量代謝障礙，由線粒體呼吸鏈和胞漿酶系（如黃嘌呤氧化酶）產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。近年來(lái)Crompton［6］論述了ROS的形成增多導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開(kāi)放。PTP開(kāi)放后可導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡［6－9］。Lewen A［10］等也認(rèn)為T(mén)BI后氧自由基產(chǎn)生增加可以導(dǎo)致線粒體功能紊亂，增加的氧自由基與鈣離子相互作用導(dǎo)致線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，細(xì)胞色素c（Cytc）從損壞的線粒體釋放，通過(guò)caspase依賴(lài)方式，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

神經(jīng)節(jié)苷脂是一種酸性鞘糖脂，廣泛存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞膜、神經(jīng)組織等結(jié)構(gòu)中，其主要活性成分是GM－1。在缺血、缺氧的病理過(guò)程中，腦內(nèi)GM－1含量下降［11］。因此腦損傷后補(bǔ)充外源性神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性極其重要。Edaravone（3－methyl－1－phenyl－2－pyrazolin－5－one）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)上市的新型腦保護(hù)劑和自由基清除劑。一項(xiàng)關(guān)于心肌缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)證明Edaravone能作用于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP），能減少心肌細(xì)胞凋亡以及減輕線粒體的腫脹程度［12］。本研究應(yīng)用Marmarou腦創(chuàng)傷模型，在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，Edaravone和GM－1均能降低由線粒體釋放的Cytc的表達(dá)并減少腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，達(dá)到其腦保護(hù)的作用，聯(lián)合組效果更為顯著。其可能的作用機(jī)制為：依達(dá)拉奉減少自由基生成，起到了保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞膜完整性作用，有利于GM－1嵌入神經(jīng)細(xì)胞膜，GM－1嵌入神經(jīng)細(xì)胞膜后恢復(fù)Na＋－K－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋ATP酶活性，防止鈣超載，改善線粒體功能及受損細(xì)胞的能量代謝，對(duì)多種炎性因子及細(xì)胞因子的表達(dá)起其調(diào)控作用，對(duì)依達(dá)拉奉起正反饋?zhàn)饔茫?3］。本研究經(jīng)Edaravone和GM－1干預(yù)后，DBI后72h大鼠的神經(jīng)生理功能的缺陷程度明顯改善，聯(lián)合應(yīng)用Edaravone和GM－1治療效果更為明顯。說(shuō)明Edaravone和GM－1腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性損傷調(diào)節(jié)中發(fā)揮著協(xié)同保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的重要作用。腦創(chuàng)傷后聯(lián)合應(yīng)用Edaravone和GM－1進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)值得臨床推廣應(yīng)用。

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尹立國(guó)（1973－），男，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事顱腦創(chuàng)傷與腦血管病研究。

2013－11－19）

1007－4287（2014）10－1594－03