萬 哲，劉 紅，張 真，許 垚，郭也也，吳紫鶯，劉 映，祝 軍＊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院臨床專業(yè)，湖南長沙410000）

A－NK細(xì)胞促口腔鱗狀細(xì)胞癌凋亡效應(yīng)的研究

萬 哲1，劉 紅1，張 真1，許 垚2，郭也也2，吳紫鶯2，劉 映2，祝 軍1＊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院臨床專業(yè)，湖南長沙410000）

目的通過觀察A－NK細(xì)胞對裸鼠舌鱗狀細(xì)胞癌移植瘤模型的體外生長特點以及口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）凋亡指數(shù)的檢測，探討A－NK細(xì)胞對OSCC的免疫治療機制。方法建立裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤模型，隨機分為對照組、A－NK細(xì)胞組和NA－NK細(xì)胞組，觀察33天后瘤重，繪制腫瘤生長曲線；OSCC組織標(biāo)本經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的UTP缺口標(biāo)記（TUNEL）染色以鑒定凋亡細(xì)胞，并由陽性細(xì)胞百分比表示細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果ANK細(xì)胞組第15天開始腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；NA－NK細(xì)胞組第27天后腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；A－NK細(xì)胞組第30天腫瘤體積顯著小于NA－NK細(xì)胞組（P＜0.05），且三組荷瘤裸鼠腫瘤生長重量均有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NK組病例活檢癌組織AI為（0.71±0.66）%，A－NK組織AI為（1.76±0.83）%，二者間有顯著性差異（P＜0.01）；對照組癌組織AI為（0.34±0.69）%，與前二者間有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論 A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞均可在裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)明顯的抗腫瘤效應(yīng)，且A－NK的抑瘤作用大于NA－NK細(xì)胞。NK細(xì)胞對口腔鱗狀細(xì)胞癌具有免疫殺傷效應(yīng)，該作用是通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。

A－NK細(xì)胞；NA－NK細(xì)胞；舌鱗狀細(xì)胞癌；裸鼠移植瘤；抗腫瘤效應(yīng)

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1582）

A－NK細(xì)胞被認(rèn)為是一個表型和功能獨特的NK細(xì)胞亞群，具有高水平的NK細(xì)胞毒性和增殖能力，本課題旨在探索A－NK細(xì)胞在口腔鱗癌治療中的作用效果，為A－NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113－Tb（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腫瘤生物實驗室），BALB／C－nu／nu裸小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），磁珠分選儀（（德國美天旎生物技術(shù)有限公司）），淋巴細(xì)胞分離液（sigma公司），rhIL－2（南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所），RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco）。試劑蛋白酶K、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素購自日本W(wǎng)ako公司，TdT Buffer、TdT、DTT、Biotin－16－dUTP、CoCl2購自瑞士Roche公司，dATP購自美國Phamacia Biotech公司，3，3’－diaminobenzydine（DAB）購自日本Dojin公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NK細(xì)胞的分離純化 無菌抽取正常人群外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，經(jīng)貼壁粘附和尼龍毛柱粘附去除單核細(xì)胞和B細(xì)胞。將上述分離去除單核細(xì)胞和B細(xì)胞后取得的單個核細(xì)胞（PBMC）溶紅素處理，平衡鹽充分洗滌后，加入到CD56單抗包被的磁珠系統(tǒng)中孵育，平衡鹽再次洗滌，于miniMACS分離器磁場中上柱分選，平衡鹽洗柱收集細(xì)胞。免疫磁珠儀檢測所得細(xì)胞表面CD3，CD56分子，分析NK細(xì)胞回收率和純化率。

1.2.2 A－NK和NA－NK細(xì)胞的分離 取免疫磁珠分選的高純度NK細(xì)胞，用a－MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／ml，置于無菌塑料平皿中，與6000U／ml IL－2水平培養(yǎng)3h（37℃5%CO2）。用溫a－MEM培養(yǎng)基洗脫收集非粘附的NA－NK細(xì)胞4次。加入PBS（含0.02w／vEDTA）4℃放置10min，冷a－MEM洗3次，收集粘附的A－NK細(xì)胞。

1.2.3 A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增分別將收集的A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞，用a－MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／ml，加入200 U／ml IL－2，培養(yǎng)于24孔板中。每3天更換新鮮培養(yǎng)液，補充細(xì)胞因子，保持細(xì)胞因子終濃度不變，細(xì)胞濃度在（3～4）×106／ml，并計數(shù)細(xì)胞，繪制出細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 人舌鱗癌細(xì)胞皮下成瘤裸鼠模型的建立

取指數(shù)增殖期Tca8113細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×107／ml，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞占95%以上。于每只裸鼠右前肢背部皮下接種2.0×106個（0.2ml）細(xì)胞，33天后處死，分離移植瘤，10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、制片（4μm厚），HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。1.2.5 A－NK細(xì)胞免疫功能增強對口腔癌的效應(yīng)

動物接種Tca8113細(xì)胞方法同人舌鱗癌細(xì)胞皮下成瘤裸鼠模型的建立。接種后第3天，將裸鼠隨機分為3組，每組7只，分別為對照組、NA－NK細(xì)胞組和A－NK細(xì)胞組。對照組每2天于接種腫瘤細(xì)胞的局部皮下注射0.1ml生理鹽水，NA－NK細(xì)胞組和A－NK細(xì)胞組每2天于接種腫瘤細(xì)胞的局部皮下分別注射相應(yīng)細(xì)胞0.1ml（5.0×106）個，共注射3次。于接種腫瘤細(xì)胞2周后每3天用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的最小徑a、最大徑b，計算出移植瘤體積V＝a2b／2，并得出裸鼠移植瘤體積生長曲線。第33天斷頸處死小鼠，剝?nèi)∫浦擦龇Q重。

1.2.6 A－NK細(xì)胞對口腔鱗狀細(xì)胞癌的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) ①TUNEL法具體操作按Roche試劑所附說明書進(jìn)行。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，二甲苯透明，封片。②TUNEL結(jié)果評價方法，在200倍鏡頭下，每枚切片選擇5處不同視野，辨別凋亡細(xì)胞，發(fā)生凋亡的細(xì)胞其核呈棕黃色，在癌組織中散在分布。凋亡細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比確定為AI。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件系統(tǒng)的配對樣本t檢驗、χ2檢驗及Kaplan－Meier法Log Rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞

本研究采用免疫磁珠技術(shù)對NK細(xì)胞進(jìn)行分離純化，計數(shù)細(xì)胞結(jié)果顯示：A－NK細(xì)胞數(shù)占41%，NA－NK細(xì)胞數(shù)占59%。

2.2 A－NK細(xì)胞的體外增殖能力

A－NK細(xì)胞在a－MEM培養(yǎng)基中生長良好，細(xì)胞透亮有光澤，貼附于器皿底部（見圖1），加入IL－2刺激因子后，A－NK細(xì)胞在第15天達(dá)到增殖高峰，NANK細(xì)胞于第12天達(dá)到增殖高峰。培養(yǎng)3周后，ANK細(xì)胞共增加39.33倍，NA－NK細(xì)胞僅增加16.33倍（見圖2）。

2.3 人舌鱗癌細(xì)胞皮下成瘤裸鼠模型的建立

剛接種舌鱗癌細(xì)胞的裸鼠均可見圓形小皮丘，第2天后消退，接種腫瘤細(xì)胞2周后，腫瘤開始緩慢生長，于18天后出現(xiàn)快速生長期。HE染色可見大量的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，細(xì)胞巢狀排列，呈多角型，核大，深染，部分腫瘤細(xì)胞蛻變壞死，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤，提示建模成功（見圖3）。

圖1 A－NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)（X20倍）

圖2 A－NK細(xì)胞與NA－NK細(xì)胞生長曲線比較

圖3 舌鱗癌細(xì)胞的HE染色（X200）

2.4 A－NK細(xì)胞對裸鼠移植瘤的抑制作用

A－NK細(xì)胞組第15天開始腫瘤顯著小于對照組，各時間點均P＜0.05；NA－NK細(xì)胞組第27天后腫瘤顯著小于對照組，P＜0.05；A－NK細(xì)胞組第30天腫瘤顯著小于NA－NK細(xì)胞組，P＜0.05。實驗結(jié)果提示局部應(yīng)用A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞對裸鼠口腔鱗癌移植瘤均有明顯的抑制作用，但ANK細(xì)胞組對腫瘤的抑制作用強于NA－NK細(xì)胞組（見圖4）。

2.5 三組裸鼠的瘤重比較

第33天，A－NK細(xì)胞組腫瘤重量顯著較對照組輕，P＜0.05；NA－NK細(xì)胞組腫瘤重量顯著較對照組輕，P＜0.05；A－NK細(xì)胞組腫瘤重量顯著較NA－NK細(xì)胞組輕，P＜0.05（見表1）。見圖5。

表1 第33天各組裸鼠移植瘤重量（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.6 NK細(xì)胞對口腔鱗狀細(xì)胞癌的凋亡誘導(dǎo)作用

NK組病例活檢癌組織AI為（0.71±0.66）%，A－NK組織AI為（1.76±0.83）%，二者間有顯著性差異（P＜0.01）；對照組癌組織AI為（0.34± 0.69）%，與前二者間有顯著性差異（P＜0.01）。

圖4 裸鼠移植瘤體積生長曲線

圖5 三組裸鼠的腫瘤標(biāo)本

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是由上皮組織惡變而來的口腔惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上，發(fā)病率高。盡管口腔鱗癌的治療水平不斷提高，經(jīng)過以手術(shù)、放療和化療為主的綜合序列治療后5年生存率已達(dá)到64%左右，但仍有多于1／3的患者5年內(nèi)死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害人類健康。因此，進(jìn)一步闡明影響口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的分子機制，設(shè)計新型診斷方法和有效治療藥物，對于提高口腔鱗癌患者的生存率和生存質(zhì)量具有十分重要的現(xiàn)實意義。

A－NK細(xì)胞（Adherent natural killer）是近年發(fā)現(xiàn)的表型和功能獨特的NK細(xì)胞亞群，具有高水平的NK細(xì)胞毒性和增殖能力，能識別“自己”和“非己”，對自身細(xì)胞無殺傷作用，在體外和體內(nèi)實驗中均表現(xiàn)出強大的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。但其在人體血液中數(shù)量較少，需體外擴(kuò)增以達(dá)到臨床級別的細(xì)胞數(shù)量［1，2］。體外培養(yǎng)NK細(xì)胞主要分為兩個過程：貼壁和生長，細(xì)胞黏附至培養(yǎng)介質(zhì)上，進(jìn)而鋪展，這是貼壁細(xì)胞生長的必要條件。須玨華等［3］對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在DMEM－HG，DMEM－LG，a－MEM三種培養(yǎng)基中貼壁效果進(jìn)行實驗研究，發(fā)現(xiàn)a－MEM有利于細(xì)胞貼附，本研究中采用a－MEM培養(yǎng)基，A－NK和NA－NK細(xì)胞貼服于培養(yǎng)基底，生長狀態(tài)良好。A－NK細(xì)胞具有強大的體外擴(kuò)增能力，有研究報道在IL－2參與下96hA－NK細(xì)胞增殖比NA－NK細(xì)胞快［4］，本研究中A－NK細(xì)胞和NA－NK細(xì)胞培養(yǎng)3周后，A－NK細(xì)胞共增加39.33倍，NANK細(xì)胞僅增加16.33倍，提示A－NK細(xì)胞的增殖能力強于NA－NK細(xì)胞，也證實了這一實驗研究。

良好的動物模型是研究腫瘤治療干預(yù)途徑的前提條件，SCID（Severe Combined Immune－deficiency）小鼠即嚴(yán)重免疫缺陷小鼠，是一種先天性B與T淋巴細(xì)胞雙重免疫缺陷動物，可成為腫瘤免疫治療的良好活體承載系統(tǒng)。但普通SCID小鼠有滲漏（Leaky）現(xiàn)象，約有2%－3%的子代具有少量的淋巴樣細(xì)胞，且可產(chǎn)生少量免疫球蛋白。本研究選用的是SCID／BG小鼠，它是BALB／c－beige／beige同源近交系小鼠將beige基因引入C.B－17SCID小鼠體內(nèi)，其體內(nèi)NK細(xì)胞活性降低，且滲漏現(xiàn)象大幅降低，優(yōu)于普通的SCID小鼠。

本研究中，A－NK細(xì)胞組第15天開始腫瘤顯著小于對照組，NA－NK細(xì)胞組第27天后腫瘤顯著小于對照組，可以證明局部應(yīng)用A－NK細(xì)胞與NA－NK細(xì)胞均有顯著抑瘤作用。A－NK細(xì)胞組第30天腫瘤顯著小于NA－NK細(xì)胞組，提示A－NK細(xì)胞的抑瘤作用顯著強于NA－NK細(xì)胞。

本研究中發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞可以有效的誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌的瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用，而其中A－NK細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用明顯強于NK細(xì)胞。因此，NK細(xì)胞系對于口腔鱗狀細(xì)胞癌具有有效地免疫抑制作用。可能通過多種機制抑制腫瘤細(xì)胞：（1）通過穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)途徑，二者的協(xié)同作用可使A－NK細(xì)胞產(chǎn)生最佳效應(yīng)的細(xì)胞毒作用；（2）直接接觸腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，NK細(xì)胞表達(dá)的TNF死亡配體可與腫瘤表面的死亡受體相結(jié)合發(fā)揮殺傷效應(yīng)。（3）細(xì)胞因子介導(dǎo)途徑，A－NK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，通過破壞腫瘤微循環(huán)或改變靶細(xì)胞表面的pH值，糖代謝等方式殺死腫瘤細(xì)胞。（4）ADCC介導(dǎo)途徑［5］。本實驗中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡與壞死同時存在，推斷可能是多種機制共同作用的結(jié)果。

本研究提示A－NK細(xì)胞能有效抑制裸鼠舌鱗癌移植瘤的生長，但目前國內(nèi)外對其研究還停留在基礎(chǔ)實驗階段，其具體作用機制尚不明確，因此ANK細(xì)胞直接用于臨床受多方面因素制約，尚需對A－NK細(xì)胞免疫功能重建進(jìn)行更斷深入探索研究，為臨床應(yīng)用提供合理依據(jù)。

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The experimental research of A－NK Cells and NA－NKcells on Tumor Growth Inhibition of Humantongue squamous cell car－cinoma

WAN Zhe，LIU Hong，ZHANG Zhen，et al.（Department of Stomatology，Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital，Xin jiang Medical University，Urumqi 830000，China）

ObjectiveBy observing the external growth and hyperplasia of A－NK cell，To explore the treatment effect and mechanism of A－NK on the subcutaneous transplanted tumor of tongue squamous cell carcinoma in nude mice.And provide the experimental foundation in clinical use of such treatment strategies for tongue squamous carcinoma.MethodsThe subcutaneous nude mice model with Tca8113cells was established and randomly assigned to three groups.Every group had 7nude mice.The control Group injected with normal saline，The experimental group injected with A－NK cells and NA－NKcells，All animals were killed after 33days，The tumor volumes and weight in each group were measured and to draw the curve of tumor growth.ResultsThe Volume of nude mice tumor in A－NK group is smaller than the control group after 15days（P＜0.05）；The Volume of nude mice tumor in NA－NK group is smaller than the control Group after 27days（P＜0.05）；and the Volume of nude mice tumor in A－NK group is smaller than theNA－NK Group after 30days（P＜0.05），There were significant differences among the three groups in terms of the weight of nude mice tumor（P＜0.05）.ConclusionA－NK cells and NA－NK cells can significantly inhibit the subcutaneous transplanted tumors of nude mice and the A－NK group is stronger than the NA－NK group.

A－NK cells；NA－NK cells；Tongue squamous cell carcinoma；Nude mice model；Anti－tumor effect

R739.81

A

2013－09－11）

1007－4287（2014）10－1582－04

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（201191158）

＊通訊作者