齊向濤 許 追 歐 都 許丹丹 楊 莉 齊亞銀 （新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 新疆 石河子 832000)

H9亞型屬于低致病性禽流感病毒,主要侵害雞的呼吸系統(tǒng),如果肉禽飼養(yǎng)場(chǎng)發(fā)生本病,易繼發(fā)大腸桿菌病等疾病，造成較高的死淘率。目前國(guó)內(nèi)禽流感H9亞型屬于非強(qiáng)制性免疫范圍,為了防止禽流感H9亞型病毒感染帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,免疫控制是最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施。商品代肉雞飼養(yǎng)周期短,短期內(nèi)疫苗免疫的次數(shù)和種類(lèi)較多,制定合理有效的免疫程序非常重要。本研究擬檢測(cè)本地區(qū)規(guī)模肉雞場(chǎng)其H9亞型抗體效價(jià)，抗體進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè),以期找出免疫抗體的消長(zhǎng)規(guī)律和確定最佳的免疫時(shí)間,為制訂的免疫程序提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品

1%雞紅細(xì)胞液，新城疫-H9禽流感二聯(lián)苗，H9亞型A I V診斷抗原，阿氏液，PBS液。

1.2 試驗(yàn)儀器

U型或V型微量反應(yīng)板、微量移液器、槍頭。

1.3 1%雞紅細(xì)胞液的制備

用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞，采血約2～4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。

將離心管中的血液經(jīng)1500～1800r/min離心8min，棄上清液，沉淀物加入pH 7.2，0.01mol/LPBS液，輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，第三次洗滌，輕輕混合后，再經(jīng)1500～1800 r/min離心10分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的PBS，用吸管反復(fù)吹吸使PBS與紅細(xì)胞混合均勻。取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1m L，加入9m LPBS，混合均勻即可。

1.4 血樣的采集和血清的制備

從4個(gè)實(shí)驗(yàn)基地，隨機(jī)各選取一棟雞舍，分別對(duì)7、14、21、28日齡及出欄的商品雞群采取翅下靜脈采血，每棟抽血樣30份，共采血樣600份，對(duì)血樣分離血清共480份，分離的血清置-20℃保存待檢。這些基地的雞群，在1日齡時(shí)進(jìn)行H9亞型禽流感滅活疫苗免疫。

1.5 H I實(shí)驗(yàn)

1.5.1 血凝實(shí)驗(yàn)

（1）取96孔反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上在第1排1～12孔內(nèi)加入25μL生理鹽水。

（2）在第1孔內(nèi)加入H9亞型A I V診斷抗原25μL混勻后吸出25μL加入第2孔內(nèi)再混勻后吸出25μL加入第3孔內(nèi)，依此類(lèi)推至第11孔時(shí)棄掉25μL，第12孔不加作對(duì)照孔。

（3）在1～12孔均加入25μL1%的雞紅細(xì)胞懸液。

（4）震蕩后室溫下放置30min后依次觀察結(jié)果。

1.5.2 血凝抑制實(shí)驗(yàn)

（1）配置4單位抗原。

（2）在1～12孔內(nèi)加入25μL生理鹽水。

（3）在第1孔內(nèi)加入H9亞型AIV抗血清25μL，混勻后吸出25μL加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25μL加入第3孔內(nèi)，依此類(lèi)推至第11孔時(shí)棄掉25μL，第12孔不加血清作為抗原對(duì)照孔。

（4）在1～10孔內(nèi)均加入H9亞型流感病毒4單位抗原25μL，第11孔加入SPF雞血清做陰性對(duì)照孔，第12孔加生理鹽水25μL作空白對(duì)照孔。震蕩后室溫靜止作用5min。

（5）在1～12孔內(nèi)均加入1%雞紅細(xì)胞懸液25μL震蕩，室溫下放30min后依次觀察結(jié)果。

1.5.3 結(jié)果判定依據(jù)

以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的H I效價(jià)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清的H I效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于1log2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。被檢血清H I效價(jià)≤3log2判為陰性；＝4log2判為可疑；≥5log2判為陽(yáng)性。

2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用EXCEL軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，用SPSS11.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。求效價(jià)平均值、離散度。

2.1 7日齡抗體效價(jià)

通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定肉仔雞的母源抗體滴度在7日齡時(shí)相對(duì)不高但整齊均勻，7日齡的效價(jià)主要集中在4～6log2之間，通過(guò)計(jì)算1～4基地的離散度對(duì)比可知，抗體效價(jià)整體比較集中，平均值為5 l o g2（見(jiàn)表1）。

2.2 14日齡抗體效價(jià)

14日齡肉仔雞的母源抗體較7日齡時(shí)下降很多，在2log2左右，平均值為2.1log2，表明1～14之間肉仔母源抗體下降速度較快，并且抗體效價(jià)較低，離散度比較高，表明各個(gè)雞群的機(jī)體差異較大（見(jiàn)表2）。

表1 7日齡抗體效價(jià)

表2 14日齡抗體效價(jià)

表3 21日齡抗體效價(jià)

表4 28日齡抗體效價(jià)

表5 出欄時(shí)抗體效價(jià)

2.3 21日齡抗體效價(jià)

同7日齡和14日齡相比，21日齡的雞群抗體效價(jià)已經(jīng)處在一個(gè)較低的水平，在此階段以及前后幾天，雞群對(duì)H9亞型流感病毒處于易感期（見(jiàn)表3）。

2.4 28日齡抗體效價(jià)

同21日齡相比，此日齡的抗體滴度明顯升高，表明免疫后集體已經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從離散度上看，離散度較21日齡小，4log2以下的比例相對(duì)較多（見(jiàn)表4）。

2.5 出欄時(shí)抗體效價(jià)

此階段，抗體滴度已經(jīng)處于一個(gè)相對(duì)高的水平，基本處于7log2水平，從離散度水平可知，抗體效價(jià)整體比較高且集中。說(shuō)明雞群整體免疫效果理想，但仍有個(gè)別雞群抗體效價(jià)較低。其原因可能是部分雞群機(jī)體體質(zhì)差，個(gè)別漏免，或免疫失敗，同時(shí)與雞群所處環(huán)境差異有關(guān)（見(jiàn)表5）。

3 結(jié)果與討論

3.1 白羽肉雞養(yǎng)雞場(chǎng)H9亞型禽流感病毒的防制措施（見(jiàn)表6）。

表6 白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序

3.2 免疫程序的評(píng)價(jià)分析

由圖1可知，該免疫程序合理，但整體水平較好，現(xiàn)有的免疫程序產(chǎn)生的抗體可以滿足生產(chǎn)需求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)肉仔雞而言，抗體水平一般在5～7天H I抗體平均水平為4～5 l o g2，在14天左右H I水平平均在2 l o g2，42天左右H I水平平均在6～8 l o g2之間，且分布在0～10之間，均勻度較差，肉仔雞在20天前有母源抗體的存在可以一定程度上抵抗外來(lái)病毒的感染，在20～28天母抗體降至最低（平均H I在1～2 l o g2左右），所以此階段為危險(xiǎn)期。根據(jù)試驗(yàn)和飼養(yǎng)實(shí)踐總結(jié)，對(duì)肉仔雞而言，重點(diǎn)應(yīng)落實(shí)一個(gè)“防”字，本著一個(gè)“早發(fā)現(xiàn)早治”的原則，在預(yù)防方面著重從以下幾個(gè)方面做好工作。

圖1 不同日齡H9亞型禽流感抗體效價(jià)

（1）做好場(chǎng)區(qū)清理、凈化和隔離工作，確保場(chǎng)區(qū)內(nèi)無(wú)H9亞型禽流感病毒的存在，確保所有進(jìn)場(chǎng)的車(chē)輛、人員、物品都是安全的，確保攜有病毒的人員和物品與雞群徹底隔開(kāi)。

（2）做好各項(xiàng)免疫，確保雞群有較好的抗病力。

（3）做好藥物的預(yù)防工作，制訂合理的投藥計(jì)劃，有計(jì)劃有目的用藥，制訂適合肉雞的藥物預(yù)防計(jì)劃，藥品可以自主選擇，把握好用藥時(shí)間和階段。

（4）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少雞群各種應(yīng)激。

4 結(jié)論

對(duì)本地區(qū)規(guī)模化商品代白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)11日齡免疫前后雞群的H9亞型禽流感H I抗體的消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行調(diào)查可知：H9亞型H I抗體滴度在11日齡前離散度較小，抗體滴度趨于集中，均勻度較好，11日齡免疫后個(gè)體H9亞型H I抗體滴度均勻度較差，尤其在21日齡時(shí)，這可能與IBD等免疫對(duì)H9免疫有一定的影響有關(guān)。