紀松崗，丁璇，曹巖，陳嘯飛，賈丹，王冬堯，柴逸峰(.解放軍40醫(yī)院藥劑科，山東青島 6607;.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 00433)

·論著·

用SMMC-7721和Hep-G2全二維細胞膜-整體柱色譜聯用技術篩選中藥鴉膽子的抗癌活性物質

紀松崗1，丁璇2，曹巖2，陳嘯飛2，賈丹2，王冬堯2，柴逸峰2(1.解放軍401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071;2.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433)

目的 篩選中藥鴉膽子中的抗癌活性成分。方法同時使用全二維色譜技術和細胞膜色譜技術聯用質譜技術。結果經初步分離篩選，得到了腺苷和鴉膽子苦素B兩種潛在的抗癌活性成分。結論該方法對中藥中活性成分的篩選，具有快速、高效和在線的特色和優(yōu)點。

細胞膜色譜;全二維色譜;SMMC-7721;Hep-G2;鴉膽子;抗癌

細胞膜色譜作為近幾年來新興的一種活性成分篩選技術，因其在線、高通量、自動化的優(yōu)點，被越來越多的用于中藥活性成分的篩選研究［1］。該技術原理簡單，即使用細胞膜與硅膠進行孵育，得細胞膜-硅膠固定相，該固定相具有生物活性，使用該固定相裝填色譜柱，得到可以用于常規(guī)液相條件下的細胞膜色譜柱，從而實現在線的自動化高通量篩選［2］。中藥鴉膽子是苦木科植物鴉膽子Brucea javanica(L)Merr.的干燥成熟果實，近幾年來有研究證明從中提取得到的鴉膽子油具有潛在的抗癌活性［3］，我國于1978年開始研制鴉膽子油乳，并用于治療各種惡性腫瘤，使用該劑型與化療和放療聯合使用，可以顯著改善治療效果(P＜0.05)［4］，但是其具體活性成分有待進一步驗證。因此，細胞膜色譜具有高通量、快速的特點，十分適用于初步篩選鴉膽子中相關的抗癌活性成分。但是細胞膜色譜作為一種生物活性色譜，其效率較低、柱效較差［5］。為克服這些不足，本研究搭建了新型的SMMC-7721細胞-鴉膽子和Hep-G2細胞-鴉膽子的全二維細胞膜色譜-整體柱色譜的高通量活性成分篩選模型，用于篩選鴉膽子油的抗癌活性成分，可以有效提高細胞膜色譜對復雜體系成分的分離效能［6］，使得篩選結果更加穩(wěn)定可靠。

1 儀器和材料

1.1 儀器Angilent-1200高效液相色譜儀(美國，安捷倫科技有限公司)，Angilent-6200飛行時間質譜儀(美國，安捷倫科技有限公司)，Chromolith RP 18e col-umn整體柱(德國，默克集團有限公司)，RheodynetitanMX型電子控制十通閥(美國，藝達思科技有限公司)，十萬分之一電子天平(美國，梅特勒公司)。

1.2 材料SMMC-7721細胞，Hep-G2細胞，硅膠(5 μm，大連美侖公司)，乙腈(色譜純，默克公司)，甲酸(色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司)，水由Milli-Q超純水純化系統(tǒng)制備，鴉膽子(上海雷允上藥房)，石油醚為分析純，伊馬替尼對照品(南京安格醫(yī)藥化工有限公司)，四環(huán)素對照品(中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法

2.1 SMMC-7721和Hep-G2細胞膜色譜的制備取一定量的SMMC-7721或Hep-G2細胞(3.5× 107)，經超聲破碎后，低速離心10 min，取上清液12 000 g高速離心20 min，得細胞膜沉淀。然后將所得細胞膜沉淀物用5 ml生理鹽水復溶，與活化硅膠混合，在真空條件下渦旋反應5 min，之后轉入4℃冰箱中孵育12 h，得到細胞膜-硅膠固定相。

將孵育好的細胞膜色譜固定相取出，用PBS離心清洗3次(1 000 r/min，5 min)，再用4 ml PBS復溶，進行細胞膜色譜柱裝填操作。將裝填好的細胞膜色譜柱用PBS在37℃下，用10 mmol/L醋酸銨溶液，以流速0.2ml/min，平衡1 h即可使用，每次進樣量為5μl。

2.2 鴉膽子活性部位的提取用石油醚作為提取溶劑，按照7:1的液料比，在60°C水浴和400W的超聲條件下，提取2 h，完成鴉膽子活性部位的提取。

2.3 整體柱條件的探索色譜柱:Chromolith RP 18e column(100 mm×4.6 mm，5μm，德國，默克集團有限公司);流動相:A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈;柱溫:26℃;總流速:5.0 ml/min;具體梯度洗脫條件見表1。

圖1 全二維整體柱-細胞膜色譜系統(tǒng)

表1 整體柱梯度洗脫條件

2.4 質譜條件飛行時間質譜儀使用電噴霧正離子全掃描模式。掃描范圍:110～1 100 m/z;毛細管電壓:3 500 V;霧化器壓力:30 psi;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:350℃;碎片電壓:120 V;分流比1∶10。

2.5 二維色譜模型的搭建全二維細胞膜-整體柱-飛行時間質譜儀系統(tǒng)由三大部件組成。如圖1所示，該全二維系統(tǒng)包含一臺Agilent1200的高效液相色譜儀，一臺Agilent6200系列的飛行時間質譜儀，以及一個可以切換A、B兩種連接狀態(tài)的十通閥。泵3將第一維細胞膜色譜中分離的成分沖入樣品儲備環(huán)中，待進入第二維色譜進行進一步的分離分析。為加快全二維分析速度，十通閥上接有兩個500μl的樣品儲備環(huán)，將這兩個儲備環(huán)中的樣品，根據第二維色譜的分析分離時間，定為每隔320 s即自動切換A和B狀態(tài)進樣，由泵1和泵2按照梯度洗脫程序沖入整體柱色譜進行第二維的分離，并于飛行時間質譜儀進行分析鑒別。當十通閥狀態(tài)切換至A時，泵3將5μl鴉膽子提取液沖入細胞膜色譜柱，再富集于定量環(huán)1中，經過2.5min富集后，定量環(huán)中充滿富集的組分，泵3停止工作，切換至B狀態(tài);此時泵1和泵2按照梯度洗脫程序，將定量環(huán)1中富集的組分沖入整體柱中進行分離，利用TOFMS進行成分分析，而泵3再次開始工作并于2.5min后停止，停止后等待整體柱分析完成后再切換回A狀態(tài)。利用該切換閥的自動切換功能，使其在A和B狀態(tài)間如此相互切換，從而實現鴉膽子活性成分在細胞膜色譜柱和整體柱上的在線全二維分析。

3 結果

3.1 全二維細胞膜色譜模型的適用性考察Hep-G2細胞核SMMC-7721細胞作為肝癌細胞系，具有豐富的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)［7，8］。因此，本研究采用具有EGFR拮抗性的伊馬替尼作為陽性對照品［6］，采用四環(huán)素作為陰性對照品［9］，對搭建的全二維整體柱-細胞膜色譜模型進行了適用性考察，兩種對照品的保留情況如圖2所示，縱坐標代表一維色譜(整體柱色譜)上的保留時間，橫坐標代表二維色譜(細胞膜色譜)上的保留時間，顏色深淺分別代表活性成分的響應值從低到高。其中陰性對照品四環(huán)素(1)并無明顯保留趨勢，而陽性對照品伊馬替尼(2)則具有較為明顯的保留行為。結果表明，所搭建的全二維色譜具有相應的生物學活性，可以用于藥物活性篩選實驗。

圖2 系統(tǒng)適用性考察

3.2 鴉膽子提取液中活性成分的篩選利用所搭建好的全二維細胞膜色譜模型，對鴉膽子提取液進行了活性成分篩選實驗。根據文獻，構建了鴉膽子提取液中所含活性成分的化合物庫，通過使用提取離子的方法，利用masshunter軟件，自動對所得總離子流圖進行［M+H］+峰提取，根據文獻調研構建的化合物庫，對比得到了腺苷(3)和鴉膽子苦素B(4)兩種潛在活性物質，其在細胞膜色譜上的保留行為良好，有明顯的拖尾行為，具有潛在的生物學活性，如圖3所示。

圖3 活性成分篩選結果

4 結論

本研究利用細胞膜色譜技術、在線全二維技術和HPLC-TOFMS技術聯用，實現了對中藥鴉膽子活性成分的在線全二維篩選，篩選和分離結果快速、準確，共鑒定出兩個潛在的有效成分，其藥理活性和作用還需進一步研究。該方法充分利用了細胞膜色譜的生物學活性、全二維技術的分離效能和質譜技術的鑒定能力，改善了傳統(tǒng)細胞膜色譜分離效果差的現狀，實現了在線的活性成分篩選和鑒定，操作簡便、節(jié)省時間、分離效果良好，可以為天然產物活性成分的分離分析提供一個良好的解決途徑。

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Screening of potential active anti-cancer com ponents of Brucea javanica by SMMC-7721 and Hep-G2 com prehensive two dimensional CMC-monolith chromatography

JISonggang1，DING Xuan2，CAO Yan2，CHEN Xiaofei2，JIA Dan2，WANG Dongyao2，CHAIYifeng2(1.Department of Pharmacy，No.401 Hospital of PLA，Qingdao 266071，China;2.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toscreen potential active anti-cancer components of Brucea javanica.MethodsThis research has employed comprehensive two dimensional chromatographic technology and cellmembrane chromatographic technology simultaneously with mass spectrometry as detector.ResultsAdenosine and Bruceine B were found to be potentially anti-cancer active.ConclusionThis study has combined the advantages of online，high speed and high throughput for the screen of potential active components of traditional Chinesemedicine.

cellmembrane chromatography;comprehensive two dimensional chromatography;SMMC-7721;Hep-G2;Brucea javanica;anti-cancer

O657.7 ［文獻標志碼］A ［文章編號］1006-0111(2014)06-0425-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.007

2014-09-04

2014-10-08［本文編輯］陳靜

國家自然科學基金青年項目(12401900802).

紀松崗，博士，主任藥師.E-mail:jisonggang@126.com.［通訊作者］柴逸峰，博士，教授.E-mail:yfchai@smmu.edu.cn.