楊 梅 張艷杰 朱海萍 王 丹 王曉蓉 高秋琦 李卓英 潘景業(yè)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 溫州 325000

燈盞花素對(duì)膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊 梅 張艷杰 朱海萍 王 丹 王曉蓉 高秋琦 李卓英 潘景業(yè)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 溫州 325000

目的 觀察燈盞花素對(duì)膿毒血癥模型大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用。方法 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒血癥模型組和燈盞花素大、中、小劑量組，每組12只。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制大鼠膿毒血癥模型。燈盞花大、中、小劑量組在造模后立即分別給予燈盞花素5、10、20mg/kg尾靜脈注射。術(shù)后24h處死大鼠，下腔靜脈取血測(cè)定肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）水平，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、腎損傷分子1（KIM-1）的水平；摘取腎組織標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，免疫印跡法檢測(cè)腎臟NGAL和KIM-1蛋白含量。結(jié)果 與膿毒血癥組比較，燈盞花素大、中劑量組大鼠血清Scr、BUN、NGAL和KIM-1水平及腎組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P均＜0.05）；腎臟病理改變好轉(zhuǎn)。燈盞花素小劑量組腎臟病理改變未見好轉(zhuǎn)（P＞0.05）。結(jié)論 燈盞花素可以顯著改善膿毒血癥模型大鼠腎組織損傷，降低血清NGAL和KIM-1水平及腎組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)量，對(duì)膿毒血癥所致急性腎損傷具有保護(hù)作用。

大鼠；感染性休克；膿毒血癥；急性腎損傷；燈盞花素；NGAL；腎損傷分子1

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是由多種病因引起的短時(shí)間內(nèi)（幾個(gè)小時(shí)或幾天）腎功能突然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。嚴(yán)重感染和感染性休克是AKI最常見發(fā)病原因之一，約占急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF）的50%[1]。AKI發(fā)生后，又會(huì)促進(jìn)和加重其它臟器的損傷，導(dǎo)致MODS（多器官功能障礙綜合征），增加死亡率。嚴(yán)重感染的患者并發(fā)ARF的病死率高達(dá)70%，明顯高于其它原因所致ARF的病死率[2]。燈盞花素是燈盞花中提取而來，其有效成分是總黃酮[3]，主要為燈盞乙素，也含有少量燈盞甲素。具有擴(kuò)張血管、降低血液黏滯度、改善微循環(huán)、防治血栓形成的作用，在心腦血管疾病治療中已應(yīng)用多年。本研究通過建立膿毒血癥大鼠模型，給予燈盞花素干預(yù)，觀察其對(duì)膿毒血癥急性腎損傷的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 6周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，60只，體質(zhì)量225g左右，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SCXK（溫）2013-0023。所有大鼠手術(shù)前3d單獨(dú)放入代謝籠內(nèi)，給予標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的嚙齒類食物喂養(yǎng)，可自由飲水。喂養(yǎng)環(huán)境設(shè)置：12h∶12h人工白天黑夜循環(huán)，室內(nèi)溫度維持在（21±2）℃，濕度維持在（55±2）%。

1.2 藥 物 燈盞花素注射液（規(guī)格：20mg/5mL，純度＞95%，神威藥業(yè)有限公司贈(zèng)送，批號(hào)Z13020778）。

1.3 試 劑 尿素氮（BUN）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20130509）；肌酐（Cr）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20130412）；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）檢測(cè)試劑盒（北京博奧森生物有限公司，批號(hào)20130510）；腎損傷分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）檢測(cè)試劑盒（北京博奧森生物有限公司，批號(hào)20130301）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司，批號(hào)Pierce23225，NO.126）；兔抗大鼠NGAL多克隆抗體（武漢博士德公司，BA3435）；兔抗大鼠KIM-1多克隆抗體（武漢博士德公司，批號(hào)BA3537）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、膿毒血癥模型組和燈盞花素大、中、小劑量組，每組12只。燈盞花素大、中、小劑量組分別于術(shù)前及術(shù)后給予燈盞花素0.28、0.56、1.12mL尾靜脈注射；假手術(shù)組及模型組術(shù)前及術(shù)后用0.5mL生理鹽水靜脈注射。實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。大鼠予0.3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)腹部碘伏消毒，備皮和鋪無菌紗布洞巾。沿腹中線切開腹壁皮膚約1cm，用無菌鑷探查到盲腸后用手術(shù)縫線結(jié)扎盲腸（避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管），20G無菌針頭分別于被結(jié)扎盲腸頭尾端穿孔，然后擠壓盲

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血清Cr、BUN水平比較 術(shù)后24h，膿毒血癥組大鼠Scr、BUN含量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。大、中、小劑量燈盞花素治療后，大鼠Scr、BUN含量明顯下降，但仍然高于假手術(shù)組（P均＜0.05）；燈盞花素大、中劑量組大鼠Scr、BUN含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與膿毒血癥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；小劑量組與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3.2 各組大鼠血清NGAL和KIM-1水平比較 與假手術(shù)組比較，膿毒血癥組大鼠血清NGAL和KIM-1水平顯著升高（P均＜0.05）；與膿毒血癥組比較，燈腸，使其內(nèi)容物沿穿孔部位擠出0.3mL，將盲腸和擠出內(nèi)容物一起送回腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組動(dòng)物只進(jìn)行相同的操作，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔。

2.2 標(biāo)本采集及檢測(cè) 術(shù)后24h處死大鼠，收集尿液、采血、解剖腎臟去除包膜、稱重、取一半腎臟組織做光鏡標(biāo)本，余腎組織置于凍存管中放液氮保存。

2.2.1 血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）測(cè)定 血標(biāo)本常溫下放置1h，3000r/min分離血清，-20℃凍存待測(cè)。采用全自動(dòng)多功能生化分析儀嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 腎臟病理組織學(xué)觀察 取腎組織置10%甲醛固定后石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

2.2.3 腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白測(cè)定 勻漿器充分研磨、勻漿腎臟髓質(zhì)組織，RIRA細(xì)胞裂解液裂解，在冰上放置 30min，4℃、14 000r/min離心15min，棄沉淀，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白質(zhì)總量為30μg的蛋白，在12%的聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上電泳，電壓150V、約70min，在4℃、250mA電流1.5h轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入山羊抗大鼠NGAL和KIM-1抗體，4℃過夜，去一抗，TBST緩沖液洗3次，每次10min，再加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育1.5h，ECL試劑顯色并曝光成像，掃描圖像。采用Quantity One V6.42軟件分析各條帶灰度值，將各目的條帶灰度值與同一標(biāo)本內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的半定量結(jié)果。盞花素大、中劑量組NGAL和KIM-1水平明顯降低（P均＜0.05），小劑量組NGAL和KIM-1水平與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、NGAL、KIM-1水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮、NGAL、KIM-1水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與膿毒血癥組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組膿毒血癥組燈盞花素大劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素小劑量組n/只12 12 12 12 12肌酐/（μmol/L）34.03±3.26 54.70±5.02* 37.46±4.39*△39.49±4.28*△53.78±4.99*尿素氮/（mmol/L）8.59±0.90 26.85±4.90* 13.92±2.66*△14.15±2.71*△24.12±4.64* NGAL/（ng/mL）4.24±0.52 7.90±0.83* 5.13±0.59*△5.15±0.57*△7.88±0.81* KIM-1/（ng/L）21.76±3.59 100.30±13.28* 54.23±6.92*△53.76±6.67*△96.42±14.19*

3.3 腎臟組織病理改變 膿毒血癥組大鼠腎小球皺縮明顯，腎組織彌漫嗜中性粒細(xì)胞浸潤，組織間隙水腫明顯，球囊擴(kuò)張，腎小管上皮部分管型形成，細(xì)胞空泡變性、腫脹，腎小管腔閉塞，腎小管囊腔擴(kuò)張，管型形成。盞花素大、中劑量組單核—巨噬細(xì)胞浸潤較膿毒血癥組減輕，腎小管呈灶狀損害，部分腎小管上皮濁腫、空泡變性，組織間隙水腫減輕；小劑量組與膿毒血癥組病理損傷無顯著差異，見圖1（封三）。

3.4 各組大鼠腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，膿毒血癥組大鼠腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)顯著升高（P均＜0.05）；與膿毒血癥組比較，燈盞花素大、中劑量組腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05），而小劑量組腎臟組織中NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)水平與膿毒血癥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2（封三），表2。

表2 各組大鼠腎組織NGAL、KIM-1表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織NGAL、KIM-1表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與膿毒血癥組比較，△P＜0.05

組別假手術(shù)組膿毒血癥組燈盞花素大劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素小劑量組n/只12 12 12 12 12 NGAL/（ng/mL）0.57±0.06 1.33±0.11* 0.68±0.06*△0.67±0.05*△1.29±0.12* KIM-1/（ng/L）0.11±0.01 0.56±0.06* 0.10±0.01*△0.10±0.02*△0.55±0.05*

4 討論

全身感染導(dǎo)致AKI的發(fā)病率約占全部AKI的一半[1]。嚴(yán)重感染患者并發(fā)急性腎功能衰竭的病死率高達(dá)70%[4-5]，國內(nèi)研究中嚴(yán)重感染患者并發(fā)急性腎功衰竭的病死率甚至高達(dá)近80%[6]。目前全球范圍內(nèi)對(duì)膿毒血癥休克的早期治療方法不斷涌現(xiàn)，如早期目標(biāo)指導(dǎo)治療、強(qiáng)化血糖控制、應(yīng)激劑量激素治療、活性蛋白C的應(yīng)用及集束化治療等等[7]，但臨床上尚沒有能夠有效防治AKI和縮短自然病程的措施和方法。

藥理研究證實(shí)，燈盞花素是一種較強(qiáng)的活血化瘀藥物，可抑制血小板聚集，抑制內(nèi)凝血及促進(jìn)纖維蛋白原溶解，降低血黏度，改善高凝狀態(tài)和血管痙攣[8]；通過改善腎臟微循環(huán)而抑制腎小球系膜增殖和腎小球局灶硬化[9]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)燈盞花素可減輕輸尿管梗阻大鼠腎臟間質(zhì)纖維化[10]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥組大鼠出現(xiàn)明顯的急性腎臟功能損傷，病理表現(xiàn)為腎臟水腫、腎小球皺縮明顯，腎組織彌漫嗜中性粒細(xì)胞浸潤，球囊擴(kuò)張，腎小管上皮部分管型形成，細(xì)胞空泡變性、腫脹，腎小管腔閉塞，腎小管囊腔擴(kuò)張，管型形成。同時(shí)伴隨肌酐、尿素氮升高。使用燈盞花素注射液可以顯著改善膿毒血癥大鼠腎臟病理改變，并且顯著降低血清肌酐、尿素氮水平，保護(hù)腎功能。

NGAL和KIM-1是近年發(fā)現(xiàn)的急性腎損傷的新的生物學(xué)標(biāo)志物。NGAL是載脂蛋白家族成員，生理狀態(tài)下表達(dá)于中性粒細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等[11]，病理?xiàng)l件下由上皮細(xì)胞分泌。在尋找新型AKI標(biāo)記物的研究中發(fā)現(xiàn)，從缺血和腎毒性小鼠模型中可以迅速檢測(cè)到NGAL濃度升高[12]。臨床研究證實(shí)，NGAL可以被視為評(píng)價(jià)幼兒患者行體外循環(huán)后發(fā)生AKI風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)[13]。目前NGAL被認(rèn)為是一種早期的、靈敏的、非損傷性的反應(yīng)AKI的標(biāo)記物。KIM-1是腎臟近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白，正常腎組織中表達(dá)水平極低，但在受損后再生的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)并持續(xù)到細(xì)胞損傷完全修復(fù)[14]。其具有促進(jìn)上皮細(xì)胞黏附的作用，與腎損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)，尿中可檢測(cè)其可溶性片段[15]，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)隨著腎損傷的加重，KIM-1的表達(dá)具有時(shí)間依賴性[16-17]。且具有較好的敏感性和特異性[18]，為一種檢測(cè)腎損傷的理想生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，造模24h后膿毒血癥組大鼠血清NGAL和KIM-1水平及腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），燈盞花素注射液可明顯降低膿毒血癥大鼠血清NGAL和KIM-1水平及腎臟組織NGAL和KIM-1蛋白表達(dá)水平。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)燈盞花素注射液對(duì)膿毒血癥小鼠急性腎損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，燈盞花素注射液對(duì)膿毒血癥大鼠急性腎損傷具有保護(hù)作用，從而為其應(yīng)用于臨床膿毒血癥急性腎損傷患者的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具體機(jī)制還需作進(jìn)一步深入研究。

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Protective Effects of Breviscapus on Acute Kidney Injury in Rats with Sepsis

YANG Mei,ZHANG Yanjie,ZHU Haiping,WANG Dan,WANG Xiaorong,GAO Qiuqi,LI Zhuoying,PAN Jingye. Intensive Care Unit，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China

Objective To investigate the effect of breviscapine on acute kidney injury in a rat model of sepsis. Methods Sixty male Wistar rats were randomly（random number）assigned to sham operation group（n=12）,sepsis group（n=12）,and sepsis treated with breviscapine groups（36 rats were divided into 3 groups according to the dose, n=12）.The rat model of sepsis was established by cecal ligation and puncture（CLP）.The rats were injected once a day with breviseapine i.v.（5mg/kg,10mg/kg,and 20mg/kg）after CLP were done;then the rats were killed after operations for 24 h to get blood and kidney.The levels of blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（Scr）were assayed by enzymatic assays,the serum level of neutrophil gelatinase associate lipoprotein(NGAL)and kidney injury molecule 1（KIM-1）was detected by ELISA,renal tissue injury was determined by HE,and the expression of NGAL and KIM-1 in kidney was detected by western blot.Results Compared with sepsis model,rats in breviscapine groups（10mg/kg and 20mg/kg)had the levels of BUN,Scr in plasma and NGAL and KIM-1 in both plasma and renal tissue decreased（all P＜0.05）,and improved renal pathology,but no significant improvement of renal pathology was observed in 5mg/kg breviscapine group（P＞0.05）.Conclusion Breviscapine can improve renal injury by reducing the level of NGAL and KIM-1 in plasma and renal tissue,thus it has protective effects on renal function in rats with sepsis.

rats；septic shock；sepsis；acute renal injury；breviscapine；NGAL；KIM-1

2014-03-28

修回日期：2014-07-15

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y20120207）

潘景業(yè)，Tel：15868724786；E-mail：biobabry@gmail.com