彭 莉，李雙慶

(1上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海200135;2四川大學(xué)華西金卡醫(yī)院)

研究發(fā)現(xiàn)，骨量的調(diào)控不僅取決于激素水平、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、物理因素、免疫功能和遺傳基因，交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)也可對(duì)骨量調(diào)控發(fā)揮重要作用。Pasco等［1］研究發(fā)現(xiàn)，β腎上腺素能受體拮抗劑能增加骨密度，降低骨折的危險(xiǎn)性。Levasseur等［2］發(fā)現(xiàn)，懸吊大鼠喂食普萘洛爾后大鼠股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨密度較未懸吊組及安慰劑組高。SNS廣泛分布于外周組織器官，成骨細(xì)胞(OB)和骨小梁附近有交感神經(jīng)纖維存在，OB和破骨細(xì)胞(OC)上都具有β2腎上腺素能受體(ADRβ2R)［3］。骨堿性磷酸酶(bALP)是 OB的表型標(biāo)志物之一，可直接反映OB的活性或功能狀態(tài)。2007年 9月 ～2008年 3月，我們觀察ADRβ2R激動(dòng)劑/抑制劑作用于OB后對(duì)bALP比活性的影響，并探討SNS對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生(24 h)SD大鼠顱蓋骨分離得到的OB(大鼠來自四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)。主要試劑:DMEM-HG培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO);胰蛋白酶、沙丁胺醇、ICI-118551(美國(guó)Sigma公司);堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。主要儀器:CO2細(xì)胞孵箱(Heraeus);Olympus IX50倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);YJ-2450醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);LD5-2A型臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 OB分離、提取、培養(yǎng) 將10只SD大鼠浸泡于75%乙醇中，取出后經(jīng)過無菌處理，將顱骨片剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm骨片，加入胰蛋白酶消化。棄去胰蛋白酶，用培養(yǎng)基清洗數(shù)次，將骨片放入培養(yǎng)瓶中做翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)。加入適量培養(yǎng)基，使之恰好浸沒骨片。標(biāo)記細(xì)胞類型、日期和代數(shù)，置于孵箱中培養(yǎng)，至少3 d后再觀察細(xì)胞貼壁情況。待細(xì)胞從骨片周邊呈放射狀長(zhǎng)出后，換液，并小心棄去骨片，以后每3 d換液1次。細(xì)胞融合時(shí)，進(jìn)行消化傳代。第1代傳代細(xì)胞標(biāo)記為P1;培養(yǎng)細(xì)胞再度融合時(shí)，依次傳代，標(biāo)記為 P2、P3。

1.2.2 OB鑒定 取P3做細(xì)胞ALP重氮鹽法染色及礦化結(jié)節(jié)茜素紅S染色進(jìn)行OB鑒定。

1.2.3 bALP比活性檢測(cè) 取P3OB接種于6孔培養(yǎng)板和96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，將OB隨機(jī)分成3組，即ADRβ2R激動(dòng)劑組(A 組)、ADRβ2R 拮抗劑組(B組)、生理鹽水組(對(duì)照組)，A、B組分別加入不同濃度的沙丁胺醇、ICI-118551進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)培養(yǎng)后第24、72、96 h分別使用AKP測(cè)定試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，按照試劑盒規(guī)定的操作步驟操作，分別測(cè)出bALP總活性和總蛋白量，然后計(jì)算出bALP比活性值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組之間均數(shù)比較使用方差分析。如方差齊，兩兩比較用LSD法;如方差不齊，兩兩比較用Tamhane＇s法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OB的培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)第9～12天，細(xì)胞可融合80% ～90%。傳代培養(yǎng)的OB 3～4 h開始貼壁，6～8 h貼壁完全，細(xì)胞有數(shù)個(gè)突起，突起的個(gè)數(shù)和形態(tài)各不相同。傳代培養(yǎng)4～6 d后細(xì)胞融合成單層。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞突起互相連接，并可重疊生長(zhǎng)而不發(fā)生細(xì)胞間接觸抑制現(xiàn)象，重疊生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸形成結(jié)節(jié)狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，最后形成不透光的礦化結(jié)節(jié)。倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多角形、長(zhǎng)棱形、不規(guī)則形，有較多突起，胞核明顯，呈卵圓形，可見1～3個(gè)核仁，胞質(zhì)透亮、飽滿。通過細(xì)胞ALP重氮鹽法染色和礦化結(jié)節(jié)茜素紅S染色鑒定為OB。

2.2 各組OB培養(yǎng)24、72、96 h的bALP比活性 A組bALP比活性隨濃度增加而逐漸下降，B組bALP比活性隨濃度增加而逐漸上升。A、B組bALP比活性隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升。各組在24 h變化幅度較小，72、96 h變化幅度較大。24 h，A、B組與對(duì)照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05);72、96 h，A、B組與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表1。

表1 各組OB培養(yǎng)24、72、96 h的bALP比活性(U/g)

3 討論

新近研究發(fā)現(xiàn)，SNS在骨量的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cherruau等采用胍乙啶破壞交感腎上腺素能纖維的作用，發(fā)現(xiàn)切斷交感神經(jīng)后降鈣素相關(guān)肽免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維(CGRP)的數(shù)目增加，通過OB和OC上的CGRP受體可促進(jìn)OB分化增殖及抑制OC分化和成熟功能［4，5］。骨質(zhì)疏松患者的OB骨形成能力降低，骨丟失大于骨形成導(dǎo)致骨量減少。OB在骨代謝中扮演著重要角色，它的分化成熟、功能活動(dòng)以及凋亡決定了代謝過程中骨的形成與礦化的程度。激素、細(xì)胞因子等調(diào)控著OB的活動(dòng)，但它們影響OB活動(dòng)的行為與OB上表達(dá)的受體有著密切關(guān)系。OB和OC上都具有ADRβ2R，該受體激活刺激骨髓OC生成而導(dǎo)致骨量的下降;相反，抑制該受體則會(huì)促進(jìn)骨形成，增加骨量。bALP比活性反映了細(xì)胞的成骨活性，其作用是水解有機(jī)磷酸酶釋放出無機(jī)磷，用于羥磷灰石的形成，是骨形成的特異指標(biāo)。因此，我們推測(cè)SNS可能影響成骨細(xì)胞的bALP比活性，從而調(diào)節(jié)骨代謝。

體外獲取OB的方法有很多。本實(shí)驗(yàn)提取24 h內(nèi)出生的SD乳鼠頭蓋骨，采用骨組織塊貼壁培養(yǎng)法獲取OB。該方法操作簡(jiǎn)單易行，換液和傳代時(shí)采用差速貼壁法可以獲得相對(duì)純化的OB。原代培養(yǎng)3 d后可見少數(shù)OB自顱骨碎片移出，隨時(shí)間延長(zhǎng)，移出的OB增多，并且以骨片為中心，向周圍放射狀生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)的OB形態(tài)與原代相似。目前對(duì)OB在體外培養(yǎng)中鑒定檢測(cè)，除了細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察外，主要是通過檢測(cè)OB所分泌的骨組織細(xì)胞外基質(zhì)來反映其功能和成骨能力。本研究細(xì)胞內(nèi)ALP重氮鹽法染色結(jié)果和礦化結(jié)節(jié)茜素紅S染色結(jié)果，證明實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為OB。

本研究將培養(yǎng)的P3新生SD大鼠OB給予不同濃度的ADRβ2R激動(dòng)劑和ADRβ2R拮抗劑處理，結(jié)果顯示各OB組bALP比活性隨ADRβ2R激動(dòng)劑劑量增加逐漸降低，隨ADRβ2R拮抗劑劑量增加而逐漸上升;變化具有時(shí)間依賴性，以96 h改變最明顯。本結(jié)果表明ADRβ2R激動(dòng)劑能降低bALP比活性，從而抑制OB的成骨能力，ADRβ2R抑制劑則提高bALP比活性，而促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨能力。說明交感神經(jīng)遞質(zhì)可以通過ADRβ2R調(diào)節(jié)OB的活動(dòng)，從而影響骨代謝。

［1］Pasco JA，Henry MJ，Sanders KM，et al.Beta-adrenergic blockers reduce the risk of fracture partly by increasing bone mineral density:geelong of teoporsis study［J］.J Bone Miner Res，2004，19(1):19-24.

［2］Levasseur R，Sabatier JP，Potrel-Burgol C，et al.Sympathetic nervous system as transmitter of mechanical loading in bone［J］.Joint Bone Spine，2003，70(6):515-519.

［3］盛健，崔燎.下丘腦—瘦素—交感神經(jīng)系統(tǒng)和骨量的調(diào)控［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2005，(5):333-335.

［4］Cherruau M，Morvan FO，Saffar JL.Chemical，sympathectomy-induced changes in TH-，VIP-，and CGRP-immunoreactive fibers in the rat mandible periosteum:influence on bone resorption［J］.J Cellular Physiol，2003，194(3):341-348.

［5］韓慶林，茍三懷，王琪.降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)調(diào)控成骨細(xì)胞功能研究進(jìn)展［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2005，13(7):544-549.