張 妹， 過世東

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

鈣是人體的重要組成物質，是人體中所含各種有機和無機元素排行第五大元素，鈣在人體內幾乎參與了所有的生命活動。最新的科學研究表明，人體之所以衰老或者發(fā)生疾病，與鈣的代謝發(fā)生紊亂，使細胞內外的鈣濃度發(fā)生變化密切相關。近年來，越來越多人注意補鈣的問題。理想的鈣劑應具備鈣含量高、吸收效率高、無副作用、服用方便、口感好等特點，若含有人體所需要的多種氨基酸、維生素及微量元素等物質則更為理想。

目前市場上補鈣產品吸收率差別不是很大，一般在20%~40%[1]。目前國內外補鈣制劑繁多，但無機鈣鹽占主導地位，無機鈣鹽價格便宜但吸收率低易在腎臟停留，導致腎結石等疾病，如碳酸鈣長期服用可能產生大便干燥、食欲不振、胃疼等副作用。近年來，國內外對補鈣制劑的研究集中在有機鈣方面，但有機鈣鹽也存在不同的毒副作用，如乳酸鈣長期服用容易產生疲勞；葡萄糖酸鈣能引起糖尿病患者血糖升高；醋酸鈣能引起腹瀉等[2-4]。新型可溶性有機鈣，氨基酸鈣為代表，其特點是：穩(wěn)定性好，易吸收；量小高效；長期服用無毒副作用，人體在攝人氨基酸螯合物時，同時攝入了一般食物中往往缺乏的2種營養(yǎng)物質—微量元素和氨基酸，具有雙重營養(yǎng)作用在微量攝入時，氨基酸鈣中鈣的吸收不是以離子形式而是以整個螯合物形式被吸收的，是一種較為理想的鈣制劑。作者以魚蛋白酶解液與骨粉鈣制備螯合鈣，通過單因素實驗和正交試驗，得出較佳的螯合條件，為開發(fā)魚類下腳料增加其附加值提供參考，為開發(fā)鈣營養(yǎng)添加劑的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

魚下腳料：廣西百洋集團提供；鈣離子溶液、魚蛋白水解液：自制；酸性蛋白酶：無錫銳陽生物有限公司產品；無水乙醇，鹽酸、氫氧化鈉均為分析純試劑。

1.2 主要儀器和設備

萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司產品；超微粉碎機：桓臺東奇粉體有限公司產品；DSHZ-300水浴恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠產品；冷凍干燥機：美國熱電公司產品；原子吸光光譜儀：東芝株式會社產品；傅里葉變換紅外光譜儀：美國賽默飛公司產品；DL-5離心機：上海安亭科學儀器廠產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨鈣溶出工藝流程 魚骨→干燥→粗粉碎→超微粉碎→鹽酸酸解→離心分離→過濾→游離鈣溶液

1.3.2 螯合工藝流程 酶解液、游離鈣→調節(jié)pH、溫度、時間、質量比→攪拌螯合→一定體積比的無水乙醇→離心去上清液→干燥→粉碎→產品

1.4 指標的測定方法

水解度：電位滴定法；鈣的測定：原子吸光光度計；螯合物的定性：紅外光譜法。

2 結果與分析

2.1 產物的鑒定

取1~2 mg干燥的氨基酸多肽樣品和干燥的螯合鈣產物分別與干燥的KBr（A R級）粉末（質量約樣品的50倍）在瑪瑙研缽中研磨成混合細粉末。裝入模具內，在壓片機壓制成片測試，得紅外光譜分析圖 1，圖 2。

圖1 氨基酸多肽的紅外光譜圖Fig.1 Infrared Spectrum of Multi-peptide amino acid

圖2 氨基酸多肽螯合鈣的紅外光譜圖Fig.2 Infrared Spectrum of Chelated Products

紅外光譜整個范圍可分為4 000~1 300 cm-1與1 300~600 cm-1兩個區(qū)域。4 000~1 300 cm-1區(qū)域的峰是由伸縮振動產生的吸收帶。由于基團的特吸收峰一般位于此高頻范圍，并且在該區(qū)域內，吸收峰比較稀疏，因此它是基團鑒定工作最有價值的區(qū)域，稱為官能團區(qū)。在1 300~600 cm-1區(qū)域中，除單鍵的伸縮振動外，還有因變形振動產生的復雜光譜，當分子結構稍有不同時，該區(qū)的吸收就要細微的差異。這種情況就像每個人的都有不同的指紋一樣，因而稱為指紋區(qū)。

由氨基酸多肽溶液的紅外光譜圖1與螯合產物的紅外光譜圖2可見，在特征區(qū)，—NH2的吸收峰由3 417.81 cm-1移動到3 424.04 cm-1：C=O的吸收峰由2 959.87~2 928.83 cm-1移動到 2 360.23~2 342.33 cm-1，由兩圖對比可見，氨基與羧基氧都參與了反應，與鈣離子形成配位（p-π）螯合物，證明了螯合鈣的生成。

2.2 游離鈣制備

將魚骨清洗，去脂，自然風干，粗粉碎過篩，得100目骨粉，超微粉碎5 min。選擇時間、溫度、骨粉質量/鹽酸體積比、鹽酸濃度4個因素進行4因素3水平的正交實驗，用L9（34）正交表安排實驗并方差分析，結果如表1。

根據(jù)表1，可以得出骨鈣溶出最佳組合是A1B3C3D3， 因素影響順序：B＞A＞D＞C。 用最佳組合A1B3C3D3，得到骨鈣溶出率為74.7%。因此，骨鈣溶出工藝條件是：溫度50℃、時間100 min、鹽酸濃度4 mol/L、鹽酸量12 mL/g骨粉。

2.3 螯合單因素實驗

2.3.1 pH對螯合反應的影響 在溫度為60℃，氨基酸多肽∶離子鈣的質量比為2∶1，螯合時間為60 min，乙醇體積比 7∶1，選取 pH 值 3、4、5、6、7、8、9 做梯度試驗。結果見圖3。

圖3 pH對螯合反應的影響Fig.3 Influence of pH value on Chelate Ratio

由圖3可以看出，在pH值為3到5時螯合率不斷升高，在pH值5到9呈下降趨勢。分析原因為當H+大量存在時，H+將會與Ca+爭奪供電子基團，不利于螯合物的生成，當pH超過6以后，OH-與供電子基團爭奪Ca+優(yōu)先結合生成氫氧化鈣沉淀，故pH選擇在5左右為適宜。

2.3.2 螯合溫度對螯合反應的影響 在氨基酸多肽∶離子鈣的質量比為2∶1，螯合時間為60 min，pH值 4， 乙醇體積比 7∶1， 選取 30、40、50、60、70、80、90、95℃，做梯度試驗。結果見圖4。

圖4 螯合溫度對螯合反應的影響Fig.4 Influence of Temperature on Chelate Ratio

由圖4可以看出，溫度低于90℃螯合率緩慢上升，而高于90℃時螯合率卻急劇下降，當溫度為90℃，螯合率達到最高。分析原因可能是鰲合過程是一個動態(tài)平衡的反應，當溫度上升，加速了反應離子的運動，加大了螯合反應，鰲合反應大于解離反應，所以隨著溫度的上升螯合率增加，當溫度大于90℃時，解離反應大于螯合反應，螯合率呈現(xiàn)下降趨勢。故溫度選擇90℃為適宜。

2.3.3 螯合時間對螯合反應的影響 在溫度為60℃，氨基酸多肽∶離子鈣的質量比為2∶1，pH值4，乙醇體積比 7∶1， 選取螯合時間，30、60、90、120、150 min做梯度試驗，結果見圖5。

由圖5可以看出，隨著時間的延長，螯合率不斷升高，但是當時間超過60 min后，螯合率曲線變化平緩。分析原因可能是離子和供電子基團是不停的運動的，并不停的反應，當達到一定時間后，Ca+或者供電子基團達到飽和，螯合率就不再增加。故時間選擇在60 min為適宜。

圖5 螯合時間對螯合反應的影響Fig.5 Influence of Time on Chelate Ratio

2.3.4 質量比對螯合反應的影響 在溫度為60℃，螯合時間為 60 min，pH值4，乙醇體積比7∶1選取氨基酸多肽∶離子鈣的質量比為 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1做梯度試驗，結果見圖6。

圖6 質量比對螯合反應的影響Fig.6 Influence of mass ratio on chelate ratio

由圖6可以看出，隨著氨基酸多肽與鈣質量比值升高，螯合率明顯增加，當比值為4∶1時，螯合率最大，但比值從2∶1往后，螯合率變化很小，比值過大就造成了浪費。當氨基酸多肽與鈣質量比值為2∶1為適宜。

2.4 螯合反應的正交實驗分析

為了進一步優(yōu)化螯合工藝，選擇時間、溫度、鈣離子/氨基酸多肽質量之比、pH 4個因素進行4因素3水平的正交實驗，用L9（34）正交表安排實驗并方差分析，結果如表2。

根據(jù)表2，可以得出螯合工藝的最佳組合是A2B2C2D3，因素影響順序：A＞B＞D＞C。 用最佳組合A2B2C2D3再次試驗，得到螯合率為90.83%。因此，螯合工藝最佳條件是：溫度80℃、時間60 min、多肽/鈣離子質量比為 2.5∶1、pH 為 5。

表2 酸解魚骨正交試驗Table 2 Chelate reaction results of orthogonal test

3 結語

探討了以羅非魚下腳料酶解液和骨粉鈣螯合，制備氨基酸多肽螯合鈣的最優(yōu)工藝條件，得出以下結論：

1）利用鹽酸酸解魚骨粉的最佳條件：溫度50℃、時間100 min、鹽酸濃度4 mol/L、鹽酸添加量12 mL/g（以骨粉計）。

2）螯合反應的最佳條件：pH 5、時間60 min、多肽液與鈣離子質量比2.5∶1、溫度80℃。

[1]劉燕萍.營養(yǎng)醫(yī)生話補鈣[M].北京：中國協(xié)口醫(yī)科大學出版社，2003.

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