姚興存， 舒留泉， 賈維寶， 劉 雪

（淮海工學院 海洋學院，江蘇 連云港 222005）

藻膽蛋白是紫菜等某些藻類特有的重要捕光色蛋白，分為藻紅蛋白（PE）、藻藍蛋白（PC）、藻紅藍蛋白（PEC）和別藻藍蛋白（APC）4大類，有的藻類中蛋白質(zhì)的含量可以高達細胞干重的25%~28%[1-2]。藻膽蛋白在食品、化妝品、醫(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用與開發(fā)利用價值。

條斑紫菜是江蘇沿海主要的養(yǎng)殖海藻，目前其主要的利用途徑是制成紫菜干品供直接食用。紫菜不僅具有獨特的風味和營養(yǎng)價值，而且在《本草綱目》中記載了其獨特的藥用價值，現(xiàn)代科學研究還表明紫菜具有降血脂、抗凝血、抗腫瘤、抗輻射等生理活性[3-5]。多年來，對紫菜蛋白質(zhì)的研究主要集中在藻膽蛋白的提取、純化與生物活性[6-7]，以及蛋白質(zhì)的酶解技術(shù)與酶解物的生物活性等方面[8-9]，對紫菜藻膽蛋白在人體中模擬消化情況尚未見研究報道。干紫菜中含有30%~40%的蛋白質(zhì)，作為食品食用時人體的消化利用情況是決定其營養(yǎng)價值的主要條件。目前，研究食物消化主要有體外法和體內(nèi)法，體內(nèi)法復雜、時間長、費用高，體外模擬消化法是根據(jù)人體胃腸消化液的主要成分與消化環(huán)境，在體外建立模擬胃腸消化體系，利用精制的消化酶在試管內(nèi)進行的消化實驗，可近似反映人體胃腸對食物的消化狀況[10-11]。

作者首先確定紫菜中藻膽蛋白的制備方法，再采用人工胃液、人工腸液進行體外消化試驗，根據(jù)游離氨基酸的生成量、消化產(chǎn)物的生物活性和SDS-PAGE圖譜考察紫菜藻膽蛋白的消化情況，以期初步明確紫菜藻膽蛋白的模擬消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜：購于本地紫菜加工企業(yè)，實驗室中將其50℃烘干至質(zhì)量恒定，高速粉碎機粉碎，100目過篩后超臨界CO2流體萃取脫除脂肪，儲于廣口瓶中干燥保存。

胰蛋白酶（酶活 2.5×105U/g）、胃蛋白酶（酶活力 3×106U/g）： 美國 BBI試劑公司產(chǎn)品； 蛋白Marker：TaKaRa生物工程公司產(chǎn)品；二苯代苦味?；―PPH）：美國 Sigma公司產(chǎn)品；三氯乙酸（TCA）、鄰苯二甲醛（OPA）、考馬斯亮藍、賴氨酸：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；Primo R多用途臺式高速冷凍離心機：美國熱電公司產(chǎn)品；全自動酶標儀：美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；E200生物顯微鏡：日本Nikon公司產(chǎn)品；JSM-639OLA電子掃描顯微鏡：日本電子株式會社產(chǎn)品；DYY-241電泳儀：北京六一電泳儀廠產(chǎn)品；KS-300超聲波細胞粉碎機：寧波科生儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 紫菜藻膽蛋白制備 準確稱取一定量干紫菜于燒杯中，以1 g∶50 mL的比例加入蒸餾水，充分混勻后，使用適當方法進行處理，使紫菜細胞受到一定程度的破壞，從而釋放其中蛋白質(zhì)。以4 000 r/min離心20 min，取上層清液，將殘渣加少量水重復溶解后重復離心1次，合并上清液并定容。將紫菜藻膽蛋白溶液加入（NH3）2SO4粉末，使其飽和度達到60%，混勻后靜置鹽析30 min，8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，加入適量磷酸緩沖液溶解沉淀蛋白，定容后保存于冰箱中備用。

1.3.2 紫菜藻膽蛋白提取率計算 藻膽蛋白提取率以提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量占樣品原料總質(zhì)量來表示，按下式計算：

式中：m1為提取液中蛋白質(zhì)質(zhì)量（mg）；m0為樣品原料質(zhì)量（mg）。

1.3.3 顯微鏡觀察與電鏡掃描 光學顯微鏡觀察：將蛋白質(zhì)提取并離心后的殘渣加入20倍的蒸餾水，混勻后取少量制作成玻片，置于顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為10×100，拍照。

電子掃描顯微鏡觀察：將處理后的紫菜葉片切取約0.5 cm×0.5 cm，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗 3次，體積分數(shù)50%、70%、80%、90%、95%梯度丙酮各1次，各15 min，100%丙酮加無水硫酸鈉2次，體積分數(shù)各 10 min，丙酮與乙酸異戊酯 2∶1、1∶1、1∶2 混合液脫水處理，各10 min，純乙酸異戊酯一次30 min[12]。在離子濺射儀上噴金后，將樣品置于掃描電鏡下1000×掃描觀察并拍照。

1.3.4 紫菜藻膽蛋白的體外消化過程 人工胃液配制[13]：準確稱取 0.4 g NaCl，0.64 g 胃蛋白酶，吸取1.4 mL的濃鹽酸，待充分溶解后定容至100 mL。人工腸液配制[13]：準確稱取1.36 g的KH2PO4加入25 mL雙蒸水，待充分溶解后加入19 mL 0.2 mol/L NaOH和40 mL的雙蒸水，混勻后加入2 g胰蛋白酶，充分溶解后用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.5±0.1，最后用雙蒸水定容至100 mL。

體外消化過程模擬：吸取10 mL人工胃液或人工腸液裝入三角瓶中，放置37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10 min。將待消化的藻膽蛋白溶液10 mL加入錐形瓶，開始計時，按照設(shè)定的時間梯度取出一定量的消化液，立即終止反應(yīng)。胃液水解反應(yīng)的終止用0.168 mol/L的NaCO3調(diào)節(jié)pH至7~8，腸液水解反應(yīng)的終止則在95℃下加熱5 min。

1.3.5 藻膽蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定 水溶液中藻膽蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定采用Lowry法，牛血清白蛋白作標準品[14]。

1.3.6 游離氨基酸質(zhì)量濃度測定 將不同的消化液加入等體積的體積分數(shù)10%TCA，4 000 r/min離心20 min，調(diào)節(jié)pH至中性，采用鄰苯二甲醛法測定游離氨基酸質(zhì)量濃度[15]，賴氨酸作標準品，以賴氨酸質(zhì)量（0~80 μg）為橫坐標（x），A340nm為縱坐標（y），得到標準曲線方程程為 y＝0.012 4x-0.043 5，R2＝0.984 2。

1.3.7 消化產(chǎn)物的抗氧化作用 消化產(chǎn)物的抗氧化活性用消化產(chǎn)物對二苯代苦味酰基（DPPH）自由基清除率表示，DPPH清除率的測定采用體外試驗法[16-17]。

1.3.8 消化產(chǎn)物SDS-PAGE分析 將10 μL紫菜藻膽蛋白消化液與10 μL樣品溶解液混合后，與蛋白Marker同時置入沸水浴中加熱5 min，冷卻到室溫，12 000 r/min離心5 min，取上清液點樣。凝膠電泳采用12 g/dL的分離膠，10 g/dL的濃縮膠不連續(xù)體系。電泳時，電壓恒定100 V，電泳3.5 h，考馬斯亮藍R250染色液染色3 h，脫色后掃描成像。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備方法對藻膽蛋白提取率的影響

表1為不同提取方法的藻膽蛋白提取率。

表1 不同提取方法的藻膽蛋白提取率Table 1 Extraction rate of phycobiliprotein by different methods

表1可見，磷酸鹽緩沖液反復凍融法、水溶脹法和超聲波法的蛋白提取率相對較高?？紤]到水溶脹法需5 d，應(yīng)用于實際生產(chǎn)則提取時間太長，所以并不是理想的提取方法。超聲法法和磷酸鹽緩沖液反復凍融法都有較高的提取率，且縮短了時間。綜合考慮各因素，使用磷酸鹽緩沖液作為提取劑結(jié)合超聲波處理法應(yīng)為最佳選擇。驗證試驗結(jié)果表明，當磷酸鹽緩沖液的濃度0.06 mol/L、超時功率400 W、空化比 3×10%、處理時間 20 min、溶液溫度 40℃、料液比為1 g∶50 mL時，紫菜藻膽蛋白提取率為（7.05±0.671）%，顯著高于任一方法單獨使用的提取效果。藻膽蛋白提取方法的研究始終是多年以來的研究熱點，除了上述方法之外，還有高壓勻漿法、組織搗碎法、球磨機研磨法、液氮凍融法、溶菌酶等[7]被眾多學者研究比較以便篩選高效合理的方法，但是不同的研究者由于研究角度的不同往往會得出不同的結(jié)論。因此，如何克服傳統(tǒng)藻膽蛋白制備技術(shù)缺陷、減少操作步驟、縮短制備時間、提高產(chǎn)品提取率，并能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，仍將是今后研究的熱點與難點。

2.2 超聲波處理的紫菜細胞顯微特征

經(jīng)過超聲波處理前后的紫菜生物體細胞在10×100的光學顯微鏡下的顯微圖片見圖1，1000倍電子掃描顯微鏡的圖片見圖2。

圖1 超聲波處理前（a）后（b）的光學顯微圖Fig.1 Optical micrograph before（a）and after ultrasonic treatment（b）

圖2 超聲波處理前（a）后（b）的掃描電鏡圖Fig.2 Micrograph before （a）and afterultrasonic treatment（b）by scanning electron microscope

由圖1（a）可以看出，未經(jīng)過任何處理的紫菜細胞形態(tài)完整，呈圓形或者橢圓形，且細胞排列整齊；而圖1（b）用超聲波處理的紫菜細胞，其破碎情況比較明顯，細胞變小且形狀各異，大多失去了原有的形狀而帶有一定的棱角；此外，細胞之間間距增大，說明有細胞液流出而占據(jù)細胞間空間，細胞結(jié)構(gòu)受到了一定程度的破壞。圖2（a）的掃描電鏡照片可以看出，在1 000放大倍數(shù)時，未經(jīng)過任何處理的紫菜葉狀體，其表面紋理排列整齊且較為平整，結(jié)構(gòu)致密；經(jīng)過超聲波處理的圖2（b）圖片顯示，其細胞表面上有明顯的裂口，可以說明是由于超聲空化作用而造成了細胞結(jié)構(gòu)的爆裂，從而促使胞內(nèi)物質(zhì)溶出提高了提取率，說明超聲輔助磷酸鹽緩沖液提取具有顯著的提取優(yōu)勢。

2.3 藻膽蛋白人工胃液消化過程中游離氨基酸和生物活性變化

由圖3可見，隨人工胃液消化時間延長游離氨基酸含量增加，特別是在0~20 min，消化產(chǎn)物中氨基酸含量的增加十分明顯，30 min以后則變化趨緩，這說明在模擬胃液消化中蛋白質(zhì)在進入胃中即與胃液混合后隨之即開始了消化，20 min之前蛋白質(zhì)開始大量被消化，產(chǎn)生了較多的游離氨基酸，30 min后氨基酸的幅度變化不大，可以說明紫菜藻膽蛋白在動物體內(nèi)的消化主要在20 min之前，紫菜蛋白質(zhì)是易被人類消化的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。此外，消化過程中，消化產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率顯示了與氨基酸含量幾乎一致的變化規(guī)律，由于氨基酸的抗氧化活性要強于未水解的蛋白質(zhì)，由此可知，紫菜蛋白質(zhì)的快速被消化對于人體及時吸收有效營養(yǎng)成分并改善生命體機能具有重要意義。

圖3 人工胃液消化過程中游離氨基酸與DPPH清除率的變化Fig.3 Changes of free amino acid and DPPH removal rate by the digestion of artificial gastric juice

2.4 人工胃腸液連續(xù)消化進程分析

如圖4所示，游離氨基酸在胃液和腸液2個消化階段總體呈逐漸上升趨勢，在消化的初始階段較迅速，隨著消化時間的延長，增加量逐漸放緩。胃液消化階段，氨基酸的質(zhì)量濃度從初始的8.70 mg/dL增加到30 min時的14.5 mg/dL，增加了66.7%，腸液消化階段，氨基酸質(zhì)量濃度從120 min時的15.8 mg/dL增加到300 min時的20.8 mg/dL，氨基酸質(zhì)量濃度有31.6%的增加?？梢?，紫菜藻膽蛋白的消化主要存在于胃液消化階段，由于在經(jīng)過胃液消化后暴露了更多的胰蛋白酶作用位點，才使得蛋白質(zhì)再度被腸液消化，游離的氨基酸得以更多產(chǎn)生，因此紫菜藻膽蛋白的腸液消化可以認為是胃液消化的補充與輔助。

圖4 紫菜藻膽蛋白胃腸液連續(xù)消化對氨基酸質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Amino acid variations of laver phycobiliprotein by the continuous digestion of gastrointestinal fluid

圖5 紫菜藻膽蛋白胃腸消化液的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of laver phycobiliprotein by the digestion of gastrointestinal fluid

由圖5的消化產(chǎn)物電泳圖可看出，紫菜藻膽蛋白在消化開始即被水解成相對分子質(zhì)量低于10 000的多肽，消化產(chǎn)物未能在SDS-PAGE圖譜上顯現(xiàn)出清晰的電泳條帶，僅在10、30、60、90 min的消化液中電泳圖譜上的低相對分子質(zhì)量部分 （約12 000~22 000）可見模糊的電泳影像且逐漸變淡，電泳圖與游離氨基酸分析結(jié)果能夠很好地相互印證。紫菜藻膽蛋白屬于低相對分子質(zhì)量的蛋白，相對分子質(zhì)量為79 000和330 000，亞基相對分子質(zhì)量為19 000、20 000[18]。胃蛋白酶是內(nèi)肽酶，對芳香族氨基酸具有特異性，其酶解產(chǎn)物為蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，人工胃液能夠在很短時間內(nèi)將絕大部分紫菜藻膽蛋白降解為多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)。

3 結(jié)語

通過研究比較幾種藻膽蛋白的提取方法，將超聲波破碎與磷酸鹽緩沖液浸泡提取結(jié)合作為藻膽蛋白的制備最佳方法，當磷酸鹽緩沖液的濃度0.06 mol/L、超時功率400 W、空化比3×10%、處理時間20 min、溶液溫度40℃、料液質(zhì)量體積比為1 g∶50 mL時，藻膽蛋白的提取率最大。光學顯微鏡和掃描電鏡觀察皆發(fā)現(xiàn)紫菜細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，顯示出細胞結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞而使藻膽蛋白的提取率提高。

建立了紫菜藻膽蛋白模擬人體胃腸消化環(huán)境的消化模型，以游離氨基酸含量和DPPH自由基清除率作為評價指標并結(jié)合SDS-PAGA電泳技術(shù)考察藻膽蛋白的消化情況。結(jié)果表明，紫菜藻膽蛋白的消化主要在胃液開始消化的30 min和腸液消化開始階段，在這一時間里產(chǎn)生了大量的氨基酸，但隨后氨基酸的產(chǎn)生量逐漸放緩，水解產(chǎn)物的抗氧化活性同樣呈現(xiàn)了與氨基酸相同的變化規(guī)律。紫菜蛋白質(zhì)是較易被人體消化的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。

[1]曾呈奎，王素娟，劉思儉，等.藻類栽培學[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1985：135-211.

[2]Lahaye M，Jegou D.Chemical and physical-chemical characteristics of dietary fibres from Ulva lactuca，Thuret and Enteromorpha compressa[J].Journal of Applied Phycology，1993，5（2）：195-200.

[3]呂鐘鐘，羅建光，管華詩.紫菜的生物活性研究進展[J].中國海洋大學學報，2009，39（5）：47-51.LV Zhongzhong，LUO Jianguang，GUAN Huashi.Progress on chemical constituents and biological activities of porphyra[J].Periodical of Ocean University of China，2009，39（5）：47-51.（in Chinese）

[4]Yoshizawa Y，Enomoto A，Todoh H，et al.Activity of marine macrophages by polysaccharides fractions from marine algae（Porphyra yezoensis）[J].Biosci，Biotech Biochem，1993，57（11）：1862-1866.

[5]Yoshizawa Y，Ametani A，Tsunehiro J，et al.Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from a marine alga（Porphyra yezoensis）：Structure-function relationships and improved solubility [J]. Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1995，59 （10）：1933-1937.

[6]張?zhí)苽?，李天?藻膽蛋白質(zhì)的提取純化與生物活性研究進展[J].生物技術(shù)通報，2010（1）：9-13.ZHANG Tangwei，LI Tiancai.Review on extraction purification and biological activity of phycobiliprotein[J].Biotechnology Bulletin，2010（1）：9-13.（in Chinese）

[7]王超，薛勇，劉鑫，等.天然藻膽蛋白純化技術(shù)研究進展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（4）：445-448.WANG Chao，XUE Yong，LIU Xin，et al.Review on purification technology of natural phycobiliprotein[J].Science and Technology of Food Industry，2011，32（4）：445-448.（in Chinese）

[8]姚翔，田亞平.低值紫菜蛋白酶解產(chǎn)物中抗氧化活性肽的純化及分析鑒定[J].食品與生物技術(shù)學報，2012，31（6）：648-653.YAO Xiang，TIAN Yaping.Purification and identification of antioxidant peptides from the product of protease hydrolysis the lowcost laver[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（6）：648-653.（in Chinese）

[9]Wenjuan Qu，Haile Ma，Zhongli Pan，et al.Preparation and antihypertensive activity of peptides from Porphyra yezoensis[J].Food Chemistry，2010，123（1）：14-20.

[10]于立梅，于新，曾曉房，等.野生山毛豆蛋白制備及體外消化模擬研究[J].食品科學，2010，31（7）：60-64.YU Limei，YU Xin，ZENG Xiaofang，et al.Preparation and in vitro digestibility of tephrosia candida protein[J].Food Science，2010，31（7）：60-64.（in Chinese）

[11]Ragab D D M，Babiker E E，Eltinay A H，et al.Fractionation，solubility and functional properties of cowpea （Vigna unguiculata）proteins as affected by pH and/or salt concentration[J].Food Chemistry，2004，84（2）：207-212.

[12]金飚，張敏，高克利.瓊花葉表皮特征與葉綠體發(fā)育超微結(jié)構(gòu)觀察[J].電子顯微學報，2012，31（6）：534-538.JIN Biao，ZHANG Min，GAO Keli.Morphological characteristics of leaf epidermis and chloroplast development in Viburnum macrocephalum f.keteleeri[J].Journal of Chinese Electron Microscopy Society，2012，31（6）：534-538.（in Chinese）

[13]程超，李偉，汪興平，等.葛仙米藻膽蛋白的體外消化特性[J].食品科學，2012，33（15）：6-10.CHENG Chao，LI Wei，WANG Xingping，et al.Digestion characteristics in vitro of phycobiliprotein from nostoc sphaeroides kuting[J].Food Science，2012，33（15）：6-10.（in Chinese）

[14]高洪峰.不同生長期壇紫菜中藻膽蛋白的含量變化[J].海洋與湖沼，1993，24（6）：645-648.GAO Hongfeng.The variation in the contents of phycobiliproteins from porphyra haitanensis collected in different growing stages[J].Oceanologia et Limnologia Sinica，1993，24（6）：645-648.（in Chinese）

[15]馮巖，馮志彪，王楠.乳清蛋白水解物游離氨基濃度測定方法比較[J].中國乳品工業(yè)，2010，38（5）：46-48.FENG Yan，F(xiàn)ENG Zhibiao，WANG Nan.Methods available for determining free amino of hydrolysate of whey protein[J].China Dairy Industry，2010，38（5）：46-48.（in Chinese）

[16]CHENG Zhihong，MOORE J，YU Liangli.High-throughput relative DPPH radical scavenging capacity [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（20）：7429-7436.

[17]KAUR G，JABBAR Z，ALAMMS，et al.Punica granatum （pomegranate）flower extract possesses potent antioxidant activity and abrogates Fe-NTAinduced hepatotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology，2006，44（7）：984-993.

[18]隋正紅，張學成.藻紅蛋白研究進展[J].海洋科學，1998（4）：24-27.SUI Zhenghong，ZHANG Xuecheng.Review on phycoerythrin research[J].Marine Sciences，1998（4）：24-27.（in Chinese）