鄒尚榮，李燕青，周波，簡鳳璧，陳諧捷（.廣州市第八人民醫(yī)院藥劑科，廣州 50060；.廣州市第八人民醫(yī)院感染科，廣州 50060）

高效抗逆轉錄病毒治療（Highly active anti-retroviral therapy，HAART）是目前抗人類免疫缺陷?。℉IV）治療的最有效和最主要的措施。初治HIV感染/艾滋病（AIDS）患者治療推薦方案為2種核苷類逆轉錄酶抑制劑（NRTIs）+1種非核苷類轉錄酶抑制劑（NNRTIs）或2種NRTIs+1種加強型蛋白酶抑制劑（PIs）（含利托那韋）[1]。拉米夫定（Lamivudine，3TC）、齊多夫定（Zidovudine，AZT）、奈韋拉平（Nevirapine，NVP）三者合用是我國目前抗HIV治療常用的三聯用藥方案之一，前兩者屬于NRTIs，而后者屬于NNRTIs。為便于臨床進行血藥濃度監(jiān)測和開展藥動學研究，本試驗以甲硝唑（Metronidazole）為內標，建立了同時測定人血漿中3TC、AZT和NVP濃度的高效液相色譜（HPLC）法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，包括G1314B型紫外檢測器、Agilent色譜化學工作站（美國Agilent公司）；XW-B型渦旋混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；AL204型電子天平（瑞士Mether Toledo公司）；5417R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；B320A型離心機（北京白洋醫(yī)用離心機有限責任公司）；DZF-6021型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

3TC對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號:101007-200701，純度＞99.7%）；AZT對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號:100672-200401，純度＞99.5%）；NVP對照品（中國藥品生物制品檢定研究院，批號:100641-200401，純度＞99.5%）；內標:甲硝唑（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號:1209205D）；乙腈、乙酸乙酯為色譜純，水為雙重蒸餾去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-水（梯度洗脫程序:0～10min為5∶95，10.1～18.8min為25∶75）；流速:0.8ml/min；柱溫:30 ℃；檢測波長:268nm；進樣量:30 μl。

2.2 對照品貯備液的制備

準確稱取3TC、AZT、NVP對照品各適量，分別置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得質量濃度為1mg/ml的對照品貯備液，貯存于4℃冰箱內避光保存?zhèn)溆?。試驗前按需用乙?水（10:90）混合液稀釋至相應濃度并混合成3TC-AZT-NVP標準溶液。

2.3 內標貯備液、內標溶液的制備

準確稱取甲硝唑適量置于10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為1mg/ml的內標貯備液，貯存于4℃冰箱內避光保存?zhèn)溆?。試驗前用乙?水（10∶90）混合液稀釋成濃度為30μg/ml的內標溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取含藥血漿0.25ml，置2.0ml離心管中，加入內標溶液（30μg/ml甲硝唑溶液）50μl，渦旋振蕩3 s，再加入乙腈0.75ml，密塞，渦旋振蕩1min，以離心半徑為8 cm、轉速為14000 r/min離心10min。吸取上清液置5.0ml的離心管內，加入乙酸乙酯3.0ml，密塞，渦旋振蕩1min，以離心半徑為8 cm、轉速為5000 r/min離心10min。吸取上清液置5.0ml的離心管內，真空干燥（42℃）至干。進樣前加入乙腈-水（10∶90）200μl，渦旋振蕩10 s溶解殘渣，以離心半徑為8 cm、轉速為5000 r/min離心10min，吸取30μl上清液進樣分析。

2.5 專屬性考察

取空白血漿0.25ml置2.0ml錐形離心管中，除不加內標外，按“2.4”項方法操作，按“2.1”項色譜條件測定，獲得空白血漿樣品的色譜圖，見圖1A；將一定濃度的3TC-AZT-NVP混合標準溶液和內標溶液加入空白血漿中，同法操作獲得色譜圖1B，3TC、AZT、NVP和甲硝唑分別在6.1、14.4、17.7、11.2min出峰；取HIV感染者同時口服3TC片（艾息?，安徽貝克生物制藥有限公司）、AZT片（克度?，東北制藥總廠）及NVP片（艾太?，浙江華海藥業(yè)股份有限公司）后收集的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C。由圖1可見，3TC、AZT、NVP及內標的測定不受血漿中內源性物質的干擾，本方法具有較高的專屬性。

圖1 典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+3TC（1 μg/ml）+AZT（1 μg/ml）+NVP（2 μg/ml）+甲硝唑（6μg/ml）；C.受試者口服3TC片（300mg）、AZT片（600mg）和NVP片（400mg）后收集的血漿樣品；1.3TC ；2.甲硝唑；3.AZT；4.NVPFig 1 Typical chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+3TC（1 μg/ml）+AZT（1 μg/ml）+NVP（2 μg/ml）+metronidazole（6 μg/ml）；C.plasma after taking 3TC tablet（300mg），AZT tablets（600mg）and NVP tablets（400mg）orally；1.3TC；2.metronidazole；3.AZT；4.NVP

2.6 標準曲線及定量下限考察

取空白血漿0.25ml，分別加入同時含有質量濃度為0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 μg/ml 3TC，0、0.25、0.5、2.5、5、25、40、50 μg/ml AZT以及0、0.5、1、5、10、50、80、100 μg/ml NVP的3TC-AZT-NVP混合標準溶液50μl，振蕩3 s，使3TC血藥濃度相當于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 μg/ml，AZT血藥濃度相當于 0、0.05、0.1、0.5、1、5、8、10 μg/ml，NVP血藥濃度相當于0、0.1、0.2、1、2、10、16、20 μg/ml。其余項按“2.4”項方法處理，進樣測定，記錄色譜。以藥物峰面積與內標甲硝唑峰面積之比（y）對藥物血漿濃度與內標甲硝唑濃度之比（x）進行線性回歸，分別得3TC、AZT、NVP回歸方程為:y＝2.095x+0.0187（r＝0.9981，n＝7）；y＝2.7668x+0.0218（r＝0.9990，n＝7）；y＝2.1348x+0.0162（r＝0.9983，n＝7）。結果表明，三者血藥濃度分別在0.05～10、0.05～10、0.1～20μg/ml范圍內線性關系良好；定量限分別為0.05、0.05、0.1 μg/ml。

2.7 精密度及方法回收率試驗

按“2.6”項方法分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8 μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質量濃度的3TC-AZT-NVP血漿質控樣品各15份，分為3批，每批5份，每批隨行標準曲線，依“2.4”項方法處理后，按“2.1”項色譜條件進樣測定，計算質控樣品的濃度。將測得量與配制量對照，考察本法的準確度（方法回收率）和精密度，結果分別見表1、表2及表3。結果表明，本法測定血漿中3TC、AZT與NVP濃度的準確性與精密度高、重現性好。

2.8 提取回收率試驗

分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質量的 3TC-AZT-NVP血漿質控樣品，處理后測定，以所得峰面積與相應濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積比較，計算提取回收率，結果分別見表1、表2及表3。結果表明，3TC、AZT與NVP低、中、高3個濃度的提取回收率對測定結果影響程度基本一致。

表1 3TC回收率與精密度試驗結果Tab 1 Results of recovery and precision tests of 3TC

表2 AZT回收率與精密度試驗結果Tab 2 Results of recovery and precision tests ofAZT

表3 NVP回收率與精密度試驗結果Tab 3 Results of recovery and precision tests of NVP

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.6”項方法分別配制低（3TC 0.1 μg/ml、AZT 0.1 μg/ml、NVP 0.2 μg/ml）、中（3TC 1 μg/ml、AZT 1 μg/ml、NVP 2 μg/ml）和高（3TC 8 μg/ml、AZT 8 μg/ml、NVP 16 μg/ml）質量的3TC-AZT-NVP血漿質控樣品，分別考察經室溫避光放置1 h和24h、凍融1次和3次、－20℃凍存3 d和7 d的穩(wěn)定性。結果3種血藥濃度3TC、AZT和NVP在上述條件下的RSD值均＜15%，符合方法學要求。

2.10 臨床樣本檢測

從我院HIV門診抽取9例HIV/AIDS患者的血漿，這些患者均服用3TC-AZT-NVP治療方案且達半年以上。血漿樣本按“2.4”項方法處理后，按“2.1”項色譜條件進行測定，結果見表4。

表4 HIV/AIDS患者血漿3TC-AZT-NVP濃度測定結果Tab 4 Determination results of 3TC-AZT-NVP blood concentration of HIV/AIDS patients

3 討論

HAART是全球公認為現今抗病毒治療HIV感染/AIDS最主要的有效措施，但所用藥物在有效抑制病毒復制的同時，毒副反應較大、耐藥及個體差異等問題突出。通過治療藥物監(jiān)測（TDM）指導臨床個體化合理用藥，提高抗病毒治療效果和患者的依從性，盡可能避免過高藥量導致的毒副作用和偏低藥量誘發(fā)耐藥等情況則顯得尤為重要。

同時檢測血漿中3TC、AZT、NVP濃度的方法，有HPLC-紫外（UV）法[2]和液-質聯用（LC-MS/MS）法[3-4]。LC-MS/MS法靈敏度高，但設備較昂貴，難將其常規(guī)應用于二、三級醫(yī)院的TDM。HPLC法穩(wěn)定性好、成本較低，可滿足抗HIV藥物臨床監(jiān)測的需要，故本研究意在探尋HPLC-UV法同時測定3種常用抗HIV藥物濃度的優(yōu)選方法，并用于TDM。

根據文獻[5]，3TC、AZT、NVP的最大吸收波長分別為275、268、282nm。最大吸收波長處的響應值（AU）從大到小分別為NVP、3TC和AZT。綜上，比較三者在268、273、278nm波長處的響應值:3TC在268nm與273nm波長處AU相近且大于其在278nm處AU；AZT在268nm波長處AU為三波長中最高；NVP雖在268nm波長處AU為中值，但亦為此處3TC及AZT AU的6～7倍。為使三者均有較好響應，故確定268nm為本研究方法的檢測波長。

將法莫替丁、司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑等作內標考察，發(fā)現司他夫定、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑在本方法的色譜條件下有較強吸收，但唯有甲硝唑的出峰時間最合適，且介于3TC和AZT之間、分離度好、內源性物質不干擾，故確定甲硝唑為內標。

3TC極性強，NVP極性弱，AZT極性介于兩者之間。單用乙腈、乙酸乙酯或叔丁基甲醚提取，難達到理想提取效果。用乙腈-乙酸乙酯混合體系（2∶1、1∶1、1∶2）作提取溶劑，3種目標藥物及內標皆能被提取。但僅采用一步液-液萃取后雜質始終較多，且雜質會隨乙腈比例的增加而增加。故采取先用乙腈沉淀后再對上清液用乙酸乙酯進行萃取的方法，結果顯示雜質明顯減少，提取效果較好。

AIDS患者常因HAART和機會性感染治療而需同時服用較多藥物。本方法對9例門診臨床樣本進行檢測，3種目標藥物及內標皆無干擾（見圖1C），證明本法可應用于AIDS患者TDM。由表4可知，患者的3TC-AZT-NVP血藥濃度存在較明顯個體差異，有必要對HAART進行TDM以確保療效穩(wěn)定。

本方法僅需用0.25ml血漿，低于文獻報道的0.50ml[2]，無需固相萃取[3]，對檢測設備要求不高[3-4]，操作簡單、快速、靈敏，檢測結果準確、重復性好，是臨床常規(guī)開展3TC、AZT和NVP血藥濃度同時監(jiān)測及藥動學研究的優(yōu)選方法。

[1]中華醫(yī)學會感染病學分會艾滋病學組.中華醫(yī)學會第五次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學術會議論文匯編[C].2011:44.

[2]Nandi U，Das A，Roy B，et al.Development and validation of an HPLC-UV method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine，and nevirapine in human plasma and its application to pharmacokinetic study in human volunteers[J].Drug Test Anal，2013，5（6）:485.

[3]Kumar VR，Reddy BR，Sreekanth K，et al.High throughput LC-MS/MS method for simultaneous determination of zidovudine，lamivudine and nevirapine in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013（921/922）:9.

[4]李周，丁存剛，葛慶華，等.人血漿中拉米夫定、齊多夫定、奈韋拉平的LC-MS/MS法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（3）:200.

[5]Herve R，Bernard M，Corinne C，et al.Determination of 19 antiretroviral agents in pharmaceuticals or suspected products with two methods using high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr B，2007，850:376.