董自星 ，張 娟 ,*，李炳薰 ，堵國(guó)成 ，陳 堅(jiān) ，李華鐘 ,*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;3.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;4.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122）

根據(jù)流行病學(xué)和臨床研究的結(jié)果，血清膽固醇過(guò)多具有誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等眾多心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，而在許多國(guó)家心血管疾病是引起殘疾和死亡的重要因素之一[1]。雖然有許多手段可以治療血膽固醇過(guò)多癥，比如藥物，但是高昂的價(jià)格和產(chǎn)生的副作用限制了它們的廣泛使用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多研究者證實(shí)，口服益生菌及其相關(guān)制品可以顯著降低人[2-3]、豬[4]、狗[5]和老鼠[6]等哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血清膽固醇水平。益生菌的降膽固醇作用與它們產(chǎn)生的膽鹽水解酶（bile salt hydrolase, BSH，EC 3.5.1.24）密切相關(guān)。該酶能將結(jié)合膽鹽水解成游離膽酸和氨基酸。由于游離膽酸的溶解度低于結(jié)合膽鹽，它便隨糞便排出體外，這就促進(jìn)了體內(nèi)的膽固醇從頭合成膽鹽以彌補(bǔ)損失，從而使膽固醇水平降低[7]。目前，商業(yè)化的羅伊氏乳桿菌（加拿大，蒙特利爾，Micropharma公司）已經(jīng)上市。這為治療血膽固醇過(guò)多癥提供了一種比較天然的方法，也使膽鹽水解酶活性成為益生菌篩選時(shí)的一個(gè)必要特征。但也有一些臨床實(shí)驗(yàn)表明益生菌對(duì)人體沒有顯著的降膽固醇作用[8-9]，因此引起了一些爭(zhēng)議。但這些益生菌是否產(chǎn)膽鹽水解酶，目前還沒有報(bào)道。

目前已在許多微生物中檢測(cè)或純化到膽鹽水解酶，包括雙歧桿菌，乳桿菌，梭狀芽孢桿菌，類桿菌和糞腸球菌等[7]。關(guān)于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）來(lái)源的膽鹽水解酶也有一些報(bào)道，主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選、克隆表達(dá)、生理生化特性、降膽固醇作用等方面，但對(duì)其降膽固醇的機(jī)理、可溶性表達(dá)、食品級(jí)表達(dá)以及底物結(jié)合機(jī)制等方面研究少。本文綜述了植物乳桿菌膽鹽水解酶的降膽固醇作用、底物結(jié)合機(jī)制以及異源表達(dá)等方面的研究，對(duì)揭示其降膽固醇的機(jī)制和開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品具有重要意義。

1 植物乳桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶的研究現(xiàn)狀

1.1 植物乳桿菌的降膽固醇作用

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多研究者已經(jīng)對(duì)植物乳桿菌的降膽固醇作用做了體內(nèi)和體外的研究。它們都證明了植物乳桿菌具有顯著的降膽固醇作用。表1列舉了一些體內(nèi)研究的結(jié)果，從中可以看出，口服植物乳桿菌能明顯降低動(dòng)物或人體的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯等的水平，特別是降低低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的比例（LDL-C/HDL-C，冠心病一個(gè)重要的風(fēng)險(xiǎn)因素[10]）。其中，不同來(lái)源的菌株使哺乳動(dòng)物體內(nèi)的總膽固醇和不利于人體健康的低密度脂蛋白膽固醇分別降低了 2.5%～33%和7.9%～42%。而口服L. plantarum K25使昆明雄性老鼠體內(nèi)的LDL-C/HDL-C降低了43.8%。但是，也有報(bào)道表明一些益生菌對(duì)人體沒有明顯的降膽固醇作用，這可能跟菌體的有效劑量和益生元的使用有關(guān)[11]。

表1 植物乳桿菌在體內(nèi)的降膽固醇作用Table 1 Cholesterol-lowering effect of different strains of L. plantarum in vivo

注：TC，總膽固醇；LDL-C，低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C，高密度脂蛋白膽固醇；TG，甘油三酯；SC，血清膽固醇。

關(guān)于乳酸菌降解膽固醇的機(jī)制，目前還沒有定論。主要存在以下幾種觀點(diǎn)：（1）同化吸收，即菌體細(xì)胞同化吸收介質(zhì)中的膽固醇，從而降低了膽固醇的含量[18]。（2）共沉淀，膽鹽水解酶使膽鹽脫結(jié)合，脫結(jié)合的膽鹽的溶解度低于結(jié)合膽鹽，它在酸性條件下易與膽固醇形成復(fù)合物沉淀下來(lái)，導(dǎo)致介質(zhì)中膽固醇含量下降[19]。（3）其他理論。盡管關(guān)于確實(shí)的機(jī)理尚無(wú)定論，國(guó)內(nèi)外大部分學(xué)者認(rèn)為是同化吸收和共沉淀的共同作用，而且乳酸菌的這種降膽固醇作用與它們產(chǎn)生的膽鹽水解酶密切相關(guān)。除了共沉淀，膽鹽水解酶降膽固醇的另一種可能的途徑是：膽鹽水解酶作用后的脫結(jié)合膽鹽在大腸內(nèi)不被吸收而隨糞便排出體外，這就促使了膽鹽由膽固醇的從頭合成，從而降低體內(nèi)的膽固醇濃度。

1.2 膽鹽水解酶基因的克隆表達(dá)

Christiaens等[20]于1992年第一次報(bào)道了植物乳桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶基因的克隆。其它來(lái)源于植物乳桿菌的膽鹽水解酶基因陸續(xù)被報(bào)道。從表2中可以看出，這些植物乳桿菌可以被分為兩大類：一類是只產(chǎn)一種膽鹽水解酶的菌，比如 L. plantarum 80、L. plantarum MBUL90和L. plantarum BBE7等，它們的膽鹽水解酶基因的大小一般為975 bp；另一類是產(chǎn)四種不同大小的同工酶的菌，例如L. plantarum ST-III和 L. plantarum WCFS1等，這可能是基因水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果[7]。這四種膽鹽水解酶基因（bsh1，bsh2，bsh3和bsh4）的大小分別為975 bp，1017 bp，987 bp和954 bp，且位于染色體的不同位置，氨基酸相似度從21%到39%。Lambert等[21]敲除L. plantarum WCFS1中膽鹽水解酶基因以后發(fā)現(xiàn)bsh1對(duì)膽鹽水解酶的酶活起到主要作用，bsh2，bsh3和bsh4在各菌株間相對(duì)保守，具有重要的生理學(xué)意義。

黃茜、戰(zhàn)媛媛和我們都發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌對(duì)植物乳桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)，它們很容易形成包涵體[22-24]。而其它來(lái)源的膽鹽水解酶基因的異源表達(dá)則很少有產(chǎn)生包涵體的報(bào)道，這可能跟它們之間的基因差異有關(guān)。為了提高重組蛋白的可溶性，黃茜等利用MBP融合標(biāo)簽對(duì)BSH進(jìn)行了融合表達(dá)，大幅提高了它的可溶性[25]；戰(zhàn)媛媛等則利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了它的可溶性表達(dá)[26]；我們利用雙精氨酸途徑的信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)了它的胞外分泌表達(dá)，但表達(dá)量不高而且胞內(nèi)還有包涵體[24]。

此外，為了使表達(dá)的BSH能作為一種治療血清膽固醇過(guò)多癥的藥物或保健品使用，需對(duì)它進(jìn)行食品級(jí)的表達(dá)，這意味著用于構(gòu)建重組菌的所有基因工具（包括質(zhì)粒載體，選擇標(biāo)記和轉(zhuǎn)化方案等）應(yīng)完全來(lái)自食品微生物。盡管Christiaens等[20]和Lambert等[21]將植物乳桿菌來(lái)源的bsh基因分別在野生菌L. plantarum 80和乳酸乳球菌中進(jìn)行了克隆和表達(dá)。但他們所用的質(zhì)粒含有抗生素抗性，因此不是完全食品級(jí)的表達(dá)。如何實(shí)現(xiàn)其食品級(jí)過(guò)量表達(dá)，也是目前亟需解決的問題。

表2 不同植物乳桿菌中膽鹽水解酶基因的遺傳信息Table 2 Genetic information of bsh genes from various strains of L. plantarum

1.3 膽鹽水解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

膽鹽水解酶屬于N-末端親核水解酶家族，它們的N端都有半胱氨酸殘基。在蛋白自動(dòng)水解酶過(guò)程中，蛋氨酸脫除后，這個(gè)半胱氨酸就成為活性位點(diǎn)，這是 N-末端親核水解酶家族的一個(gè)共同特征[7]。膽鹽水解酶通常為胞內(nèi)酶，最適反應(yīng)pH在5和6之間，對(duì)氧氣有些敏感。氧化巰基的試劑如高碘酸鈉、碘乙酸、Hg2+和 Cu2+等能夠強(qiáng)烈抑制膽鹽水解酶的活性[24,33]。而DTT等還原劑能保護(hù)酶不被氧化[24]。這些都說(shuō)明，膽鹽水解酶N-末端半胱氨酸的巰基是催化反應(yīng)的中心。

膽鹽水解酶差異最大的特性是其底物特異性。膽鹽水解酶的底物是甘氨結(jié)合膽鹽和?；墙Y(jié)合膽鹽，它主要由類固醇核心和甘氨酸/?；撬崦撍s合形成的（圖1）。這兩類膽鹽在人體內(nèi)的比例為3:1[31]。Moser等和McAuliffe等的研究表明，膽鹽水解酶先識(shí)別底物的類固醇核部分[34-35]。但是酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的結(jié)果則顯示BSH優(yōu)先識(shí)別底物的氨基酸部位，并且大多數(shù)膽鹽水解酶水解甘氨結(jié)合膽鹽的能力大于水解?；墙Y(jié)合膽鹽的能力[7]。因此，關(guān)于膽鹽水解對(duì)底物的識(shí)別位點(diǎn)還存在爭(zhēng)議，它可能對(duì)類固醇核心和氨基酸基團(tuán)都有識(shí)別作用。

圖1 結(jié)合膽鹽的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of conjugated bile salts

目前的研究也發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶主要偏向于水解酶甘氨結(jié)合膽鹽（表3）。而且大多數(shù)產(chǎn)膽鹽水解酶的植物乳桿菌水解甘氨結(jié)合膽鹽的能力也明顯高于水解牛磺結(jié)合膽鹽的能力。植物乳桿菌L. plantarum Lp-onlly對(duì)兩種底物的水解能力相同，但這是由四種膽鹽水解酶共同作用的結(jié)果。此外，進(jìn)化拓寬了膽鹽水解酶的底物特異性[31]，使它們可以水解不同的底物。為了確定L. plantarum Lp-onlly中每一種膽鹽水解酶的底物特異性，應(yīng)該分別將它們進(jìn)行異源表達(dá)，然后純化。

膽鹽水解酶的底物特異性差異跟它們的氨基酸序列以及空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此，可以從它們的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)出發(fā)來(lái)揭示它們結(jié)合底物的機(jī)制。目前信息理論法（information-theoretic approach）已廣泛應(yīng)用于尋找蛋白序列中決定底物特異性的氨基酸殘基[36]。因?yàn)橹挥玫降鞍椎陌被嵝蛄?，?duì)于那些沒有結(jié)構(gòu)報(bào)道的蛋白來(lái)說(shuō)，比如植物來(lái)源的膽鹽水解酶，這種方法是研究它們的底物結(jié)合機(jī)制的不錯(cuò)選擇。

表3 不同植物乳桿菌或其膽鹽水解酶的底物特異性Table 3 Substrate specificities of BSH proteins or different strains of L. plantarum

2 展望

綜上所述，口服產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株或純酶能顯著降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血清膽固醇水平，因此，可以用于治療和預(yù)防血清膽固醇過(guò)多癥。然而植物乳桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶的降膽固醇的機(jī)制、異源表達(dá)以及底物結(jié)合機(jī)制等方面還存在爭(zhēng)議。以下幾個(gè)方面的研究亟待加強(qiáng)：（1）確定益生菌的降膽固醇的機(jī)制，特別是BSH在其中所起到的作用。此外，使益生菌具有降膽固醇作用的有效劑量，以及益生元和益生菌的協(xié)同作用也待于進(jìn)一步研究；（2）通過(guò)共表達(dá)分子伴侶，使用低拷貝的質(zhì)粒以及與可溶性的標(biāo)簽融合表達(dá)等方法促進(jìn)BSH的可溶性表達(dá)。而且還可以通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度等發(fā)酵工程的手段減少包涵體的形成；（3）利用食品級(jí)的表達(dá)元件，包括食品級(jí)的質(zhì)粒、宿主、篩選標(biāo)記、誘導(dǎo)劑以及轉(zhuǎn)化方案等，實(shí)現(xiàn)BSH的食品級(jí)過(guò)量表達(dá)，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；（4）通過(guò)信息理論法等揭示BSH對(duì)底物的結(jié)合機(jī)制，以利于研究其水解產(chǎn)物的最終去向以及血清中次級(jí)膽鹽含量的增高是否由它所引起的，從而確定BSH的確切功能；（5）開發(fā)高效降膽固醇的菌株或相關(guān)產(chǎn)品，并用它們來(lái)控制人體的血清膽固醇水平，這具有很大的應(yīng)用潛力。

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