孫曉華，賴克強，黃軼群，王 婧，*，吳 軼，肖竹青

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.上海市食品研究所，上海200235)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的一類復(fù)雜的化合物，主要由脂質(zhì)氧化途徑和還原糖(及其氧化產(chǎn)物)與蛋白質(zhì)的游離氨基通過非酶褐變途徑產(chǎn)生［1］。食品熱加工的過程中容易產(chǎn)生AGEs，有研究者發(fā)現(xiàn)，大約10%的食源性AGEs可以被吸收進入體內(nèi)循環(huán)，并隨著年齡的增長在體內(nèi)累積［2］。人體內(nèi)AGEs的積累與人類許多疾病都有著密不可分的關(guān)系，包括糖尿病、腎病、阿茨海默爾病、衰老和動脈粥樣硬化等［3－4］。因此，控制 AGEs含量高的食品的攝入對于人類預(yù)防這類疾病尤其重要。AGEs主要包括:羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、戊糖素(Pento－s)、吡咯啉(Pyr)等。其中，CML最先在食品中被檢出，在實驗室研究中通常被作為食品中AGEs產(chǎn)生的標(biāo)志性物質(zhì)［5］。

大多數(shù)AGEs可以自發(fā)熒光，許良元等人［6］主要研究了利用熒光光譜技術(shù)檢測人體中的AGEs。但CML不能自發(fā)熒光，傳統(tǒng)的用于 CML檢測的方法——酶聯(lián)免疫法(ELISA)［7－8］、高效液相色譜熒光檢測法(HPLC－ FLD)［5，9］、氣相色譜－ 質(zhì)譜聯(lián)用法(GC－MS)［10］都存在不同程度的缺陷。由于食品體系比較復(fù)雜，ELISA法特異性抗體選擇比較困難，定量分析結(jié)果不可靠;HPLC－FLD和GC－MS法都需要將樣品衍生化，樣品處理復(fù)雜，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。而高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC－MS/MS)可以避免復(fù)雜的樣品衍生化處理，能夠進行準(zhǔn)確定量。目前已經(jīng)報道的 HPLC－MS/MS檢測 CML 的方法［11－14］存在很大缺陷和不足，多數(shù)使用C18色譜柱進行分離，C18固相萃取小柱進行凈化。而CML極性極強，如要達(dá)到在C18柱上保留必須使用離子對試劑。而離子對試劑會降低色譜柱壽命并污染質(zhì)譜的離子源。本方法首次研究用HILIC親水作用色譜柱進行分離，MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱對提取液萃取凈化，在CML的提取和檢測過程中都無需使用離子對試劑即可得到適當(dāng)保留，同時避免了HPLC－FLD和GC－MS法復(fù)雜的樣品衍生化處理過程，分析時間短，簡便快速。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37%鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、甲酸、乙酸銨、三氯甲烷、95%乙醇、硼酸、硼酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、氨水、濃硫酸 分析純，國藥集團;甲醇 HPLC級，美國 Sigma公司;CML標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，CAS號 5746－04－3)、D4－CML 標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)加拿大TRC公司。實驗室用水為Milli－Q超純水。CML和D4－CML標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解在80%甲醇水溶液中，配成100mg/L溶液，儲存在－20℃冰箱里備用，可保存6個月。

2695 Quattro Micro型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(配套MassLynxV 4.1型數(shù)據(jù)采集及處理軟件)、Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm)、SunFire C18液相色譜柱(150mm × 2.1mm，5μm)、OASIS MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱(60mg/3mL)美國Waters公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海精宏真空設(shè)備有限公司;TDL－5－A型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;UDK159全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司;Milli－Q超純水儀 美國Millipore公司;Supelclean LC－18固相萃取小柱(500mg/3mL)、Supelclean Alumina A酸性氧化鋁小柱(100mg/3mL)美國Supelco公司;CNW SCX陽離子交換固相萃取小柱(500mg/3mL)上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC條件 Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm);進樣量 10μL;流動相速率0.2mL/min;柱溫35℃;流動相A為甲醇(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)，B為水(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)。進行梯度洗脫，洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 梯度洗脫參數(shù)Table 1 Parameters for procedure of gradient elution

1.2.2 MS/MS條件 電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式，駐留時間500ms;多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);離子源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃;進樣錐電壓20V，毛細(xì)管電壓3.00kV;脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流速500L/h，錐孔氣流速50L/h，碰撞氣體為氬氣。

1.2.3 樣品處理 從上海市15個不同的油條加工點(包括市場上普通的早餐攤點A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E各3個加工點)采集油條樣品，樣品經(jīng)真空干燥后粉碎混勻。參考 Niquet－Léridon等［12］的研究進行樣品前處理。稱取0.5g粉末狀樣品，加入2mL硼酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH 9.2)和0.4mL硼氫化鈉溶液(2mol/L，含0.1mol/L氫氧化鈉)，混勻后在－4℃冰箱中放置8h進行還原反應(yīng)。根據(jù) Folch 法［15］，加入4mL 三氯甲烷－甲醇(2∶1，v∶v)溶液除去油條樣品中的油脂，同時使蛋白質(zhì)沉淀。5000r/min離心10min后，在沉淀物中加入4mL鹽酸溶液(6mol/L)，在110℃條件下酸解24h。酸解液經(jīng)真空干燥，用4mL超純水再溶解后，取1mL再溶解溶液用水定容至50mL(添加內(nèi)標(biāo)物D4－CML，使其在最終樣品溶液中濃度為100μg/L)。用3mL甲醇和3mL水分別洗凈和活化MCX小柱，取2mL上述添加D4－CML的樣品溶液過柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗凈雜質(zhì)后，用5mL含5%氨水的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液經(jīng)氮吹濃縮后，重新溶解在2mL甲醇－水(80∶20，v∶v)溶液中，得到最終樣品溶液，取適量此溶液過0.22μm有機相濾膜后，用于HPLC－MS/MS分析。

根據(jù) GB 5009.5－2010 食品中蛋白質(zhì)的測定［16］，采用凱氏定氮法對油條中的蛋白質(zhì)進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取凈化小柱的選擇

比較了C18SPE小柱、酸性氧化鋁小柱、SCX和MCX陽離子交換柱四種固相萃取小柱對加標(biāo)提取液的保留和凈化效果。C18小柱不能將CML完全保留住，在上樣流出液(應(yīng)棄去部分)中檢測出CML和D4－CML;酸性氧化鋁小柱凈化后，CML被保留在小柱內(nèi)不能流出;而經(jīng)SCX和MCX陽離子交換柱凈化后，兩者的回收率都接近100%，但MCX陽離子交換小柱對提取液的凈化效果較SCX陽離子交換小柱好。因此，本方法采用MCX陽離子交換柱凈化。

2.2 液相色譜柱的選擇

比較了C18色譜柱和HILIC色譜柱對CML的保留效果。在不使用離子對試劑的前提條件下，用5%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－95%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動相，使用C18色譜柱進樣(100μg/L CML標(biāo)準(zhǔn)溶液)分析;用80%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－20%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動相，使用HILIC色譜柱進樣(100μg/L CML標(biāo)準(zhǔn)溶液)分析;結(jié)果如圖2、3所示，在C18柱中，CML的保留時間僅為1.21min，而在HILIC柱中的保留時間為3.47min。因此選用HILIC色譜柱可以不使用離子對試劑，能達(dá)到有效的保留CML，使其與雜質(zhì)完全分離。

圖1 使用C18色譜柱時CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion spectrum of CML using C18column

圖2 使用HILIC柱時CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion spectrum of CML using HILIC column

2.3 流動相的選擇

選擇CML標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/L)進樣，通過實驗比較了流動相甲醇－水和流動相乙腈－水對CML的洗脫效果，結(jié)果表明甲醇作為有機相時，CML的峰形更尖銳，因此流動相選擇了甲醇和水。沒有添加乙酸銨和甲酸時，CML不出峰或者色譜峰拖尾嚴(yán)重，可能是由于標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液pH的差異較大所致。在甲醇和水相中分別添加了2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸，提高了離子化效率，改善了峰形，提高了靈敏度，從而降低了檢測限。實驗還討論了不同的流動相比例對CML保留時間和峰形的影響，分別選取了90%、80%、50%三個甲醇濃度作為流動相。結(jié)果在確保色譜柱對CML的保留效果的同時，80%甲醇濃度得到的CML峰形最優(yōu)，響應(yīng)最強。在此基礎(chǔ)上，為了增強CML與雜質(zhì)的分離效果，經(jīng)過實驗優(yōu)化采取了梯度洗脫程序(見表1)。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對CML進行二級質(zhì)譜掃描，CML母離子m/z 205.4主要被打碎成m/z 130.2，m/z 83.8兩類離子碎片，這與文獻(xiàn)報道一致［11－14］。本方法采用 m/z 130.2為定量離子，CML的二級質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 CML的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS fragments of CML

對錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間進行了優(yōu)化，CML和D4－CML優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

表2 MRM模式下CML和D4－CML的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters in multiple reaction monitoring(MRM)mode for CML and D4－CML

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 儀器檢出限 配制成CML濃度分別為0、1、10、50、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(其中內(nèi)標(biāo) D4－CML 濃度均為10μg/L)。經(jīng)HPLC－MS/MS檢測，得到CML和D4－CML混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖(圖4)，D4－CML和CML的保留時間均為3.47min。分別以S/N=3和S/N=10的計算方法得出儀器檢出限(LOD)為1μg/L，定量限(LOQ)為 3μg/L，表明本方法具有較高的靈敏度。

2.5.2 添加回收率和精密度 向油條酸解液中添加CML和D4－CML標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量分別為10、20、100μg/kg。每個添加濃度平行測定6次(n=6)。見表3，添加回收率為89.5%～99.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～2.6%，回收率和精密度較高。由于油條中CML含量較高，將樣品稀釋了200倍后(與添加CML濃度相當(dāng))進行添加回收實驗，樣品基質(zhì)也得到了稀釋，因而基質(zhì)效應(yīng)小，定量準(zhǔn)確度高。

2.6 油條中CML含量的測定

采集市場上15個不同加工點(包括市場上普通的早餐攤點A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E)的油條經(jīng)樣品處理后，用已建立的HPLC－MS/MS法進行CML含量測定。每個樣品平行測定三次(n=3)，測得15種不同油條樣品中的蛋白質(zhì)和CML含量見表4。油條中CML含量范圍為5.3±0.5～15.4±0.3mg/(kg樣品)，也可以用油條中蛋白質(zhì)含量來表示為69.3±8.2～182.2±3.1mg/(kg蛋白質(zhì))。

圖4 CML和D4－CML混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of CML and D4－CML mixed standard solution

由表中數(shù)據(jù)可以看出，不同來源的油條樣品中CML含量有所差異;市場上普通早餐攤點的油條中CML含量稍高于四個不同品牌連鎖店的油條;四個不同品牌連鎖店之間的油條中CML含量有較大差異。蛋白質(zhì)含量高的樣品中CML含量相對較高，不同的油條加工點對油炸溫度和油炸時間的控制上的差異也會導(dǎo)致美拉德反應(yīng)程度的不同，因而使晚期糖基化終末產(chǎn)物中CML的產(chǎn)生量有所不同。

表3 油條中CML的添加回收實驗結(jié)果(n=6)Table 3 Recovery rate of CML in fried bread sticks(n=6)

3 結(jié)論

本研究對食品中CML的提取方法進行了優(yōu)化，樣品處理無需衍生化;利用MCX固相萃取小柱凈化和HILIC色譜柱對強極性的CML進行分離，無需使用離子對試劑即可得到有效保留;建立的HPLCMS/MS CML檢測法成功地應(yīng)用于具有中國特色的油炸食品(油條)的檢測中。本方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確度高、靈敏度好，為進一步研究不同種類食品中CML含量的檢測、研究食品加工過程中影響CML的產(chǎn)生因素以及研究CML與人類疾病(糖尿病、尿毒癥、動脈粥樣硬化等)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，進而為指導(dǎo)人們改進食品加工工藝提供依據(jù)。

表4 15種不同來源油條樣品中CML含量和蛋白質(zhì)含量(n=3)Table 4 CML content and protein content in 15 different source fried bread sticks(n=3)

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