劉莉娟，朱益波，齊 斌，王立梅，*

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123;2.常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇常熟215500)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)是重要的模式生物，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵和釀造工業(yè)，同時釀酒酵母也是工業(yè)上生產(chǎn)谷胱甘肽的常見菌株［1］。在釀造工業(yè)中，釀酒酵母易發(fā)生突變，產(chǎn)生呼吸缺陷型，主要是線粒體缺失染色體阻斷了電子傳遞鏈。呼吸缺陷型酵母細(xì)胞和正常酵母細(xì)胞在形態(tài)上無多大差別，菌落較正常者小。由于其菌落較小，又稱為小菌落突變型(Petite Mutant)［2－4］。

研究發(fā)酵菌株的生理特性以及代謝調(diào)控，有助于揭示其生命活動機理，并可以通過改變細(xì)胞的生理狀態(tài)來提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成，這對發(fā)酵工業(yè)具有重要指導(dǎo)意義［5］。本實驗室采用亞硝基胍對一株釀酒酵母菌株2－10515進(jìn)行誘變，并獲得一株高產(chǎn)GSH的突變株Y518［6］。為了解突變菌株Y518的發(fā)酵特性，本文對突變菌株Y518發(fā)酵過程中的生理特性進(jìn)行了研究，以期為Y518在工業(yè)化生產(chǎn)過程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母2－10515與Y518為本實驗室保藏;3，5－二硝基水楊酸(DNS)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2，3，5－氯化三苯基四氮唑(TTC)上海金穗生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)北京鼎國生物技術(shù)責(zé)任有限公司;其他所用試劑均為分析純;YEPD培養(yǎng)基 葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，用水定容至 1000mL，pH6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基［7］葡萄糖20g，酵母提取物5g，硫酸銨5g，磷酸二氫鉀6g，硫酸鉀 3g，硫酸鎂1.5g，用水定容至 1000mL，pH6.0;TTC培養(yǎng)基［8］下層:葡萄糖1%，酵母提取物0.15%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.04%，瓊脂2%;上層:葡萄糖 0.5%，瓊脂 1.5%，滅菌;TTC1%，無菌膜過濾后，兩者于50℃混合;醋酸鈉固體培養(yǎng)基［9］醋酸鈉20g，酵母提取物 5g，蛋白胨 20g，瓊脂20g，用水定容至1000mL。

UV－2450分光光度計 SHIMADZU公司;超聲波細(xì)胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;高速臺式離心機 Thermo公司;高效液相色譜儀SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 活化后的菌株接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，30℃，180r/min，定時取樣。

1.2.2 菌落形態(tài)比較 制備適當(dāng)濃度的菌體懸浮液，涂布培養(yǎng)觀察其菌落形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞濃度測定 采用比濁法。取不同時間的發(fā)酵液4mL于4℃，10000r/min離心5min，棄上清，并用生理鹽水洗滌菌體后稀釋20倍，測定發(fā)酵液OD600值。

1.2.4 殘?zhí)呛繙y定 采用3，5－二硝基水楊酸法(DNS法)［10］。取樣后稀釋20倍在520nm處比色測定。

1.2.5 發(fā)酵pH測定 用pH計測定發(fā)酵液的pH。

1.2.6 菌體蛋白含量測定 取不同時間的發(fā)酵液4mL于4℃，10000r/min離心10min，收集菌體，并用0.85%NaCl洗3次。加入95℃的SDS樣品緩沖液500μL，煮沸 5min，冰浴上冷卻，加入 500μL 硫脲裂解液，室溫輕微振蕩1h，超聲破碎5min，10000r/min離心5min，取上清液［11］。用Lowry法定量蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.7 乙醇和甘油含量測定 準(zhǔn)確量取4mL發(fā)酵液，經(jīng)12000r/min離心5min后取上清液，經(jīng)0.22μm水系膜過濾后用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。色譜條件［12］為:Aminex HPX－87H柱有機酸分析柱(300mm×7.8mm);流動相:0.05mol/L H2SO4;流速:0.5mL/min，進(jìn)樣量:5μL;柱溫:50℃;示差折光檢測器溫度:50℃。

1.2.8 TTC檢測 菌種活化培養(yǎng)后稀釋到適當(dāng)濃度，在TTC下層培養(yǎng)基涂布，30℃培養(yǎng)2～3d，小心覆蓋TTC上層培養(yǎng)基，避光30℃培養(yǎng)3～4h，觀察菌落顏色［8］。

1.2.9 醋酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng) 菌種活化培養(yǎng)后稀釋到適當(dāng)濃度后涂布在醋酸鈉培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3d，觀察菌落生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 Y518與2－10515生長性能的比較

將同樣濃度的Y518和2－10515菌液進(jìn)行涂布后培養(yǎng)2～3d，觀察二者的菌落形態(tài)。從圖1中可以看出二者的菌落形態(tài)無明顯差別，Y518的菌落較2－10515小。在同樣條件下培養(yǎng)Y518和2－10515，每4h取樣測定菌體濃度。結(jié)果表明兩者的生長趨勢幾乎相同，接種到新鮮培養(yǎng)基后迅速開始生長，在48h達(dá)到最大值。但是Y518生長速率緩慢，其生長的最大值(OD600為15.67)低于原始菌株2－10515(OD600為19.32)(圖2)。

圖1 突變株Y518和原始菌株2－10515的菌落形態(tài)的比較Fig.1 The difference in colonial morphology between Y518 and 2－10515

圖2 突變株Y518和原始菌株2－10515細(xì)胞生長比較Fig.2 The difference in cell growth between Y518 and 2－10515

2.2 Y518和2－10515的葡萄糖代謝及發(fā)酵液pH的變化

葡萄糖作為YEPD培養(yǎng)基中的碳源，其代謝活性可表征微生物的生理生化狀態(tài)和生物活性。從圖3中可以看出2－10515與Y518葡萄糖消耗的趨勢一致，在6h時發(fā)酵液中的葡萄糖消耗完畢。但是與2－10515相比，Y518的耗糖速率明顯減慢。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)胞大量合成乙酸、乳酸并積累二氧化碳等酸性物質(zhì)，引起 pH下降［5］。從圖4中可以看出Y518在12h時前與2－10515的發(fā)酵pH相似。隨著代謝的進(jìn)行，Y518的發(fā)酵液pH逐漸低于2－10515，這可能是Y518的代謝通路發(fā)生改變，酸代謝變慢導(dǎo)致的。

圖3 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中葡萄糖含量Fig.3 Content of glucose at different fermentation time

圖4 Y518和2－10515的發(fā)酵液pH比較Fig.4 Changes of pH between Y518 and 2－10515

2.3 TTC檢測

由于突變菌株Y518的平板菌落形態(tài)與2－10515差別不大，但是菌落小，生長速率慢，因此推斷Y518可能發(fā)生了呼吸缺陷突變。實驗中采用TTC［8］染色來鑒定突變菌株Y518是否為呼吸缺陷型菌株。TTC(2，3，5－氯化三苯基四氮唑)是一種能與氧氣競爭呼吸鏈中的還原氫產(chǎn)生三苯基甲腈(TF，在細(xì)胞內(nèi)以紅色結(jié)晶體形式存在)的顯色劑。呼吸正常的酵母能夠產(chǎn)生還原氫還原TTC使菌落呈紅色，而呼吸缺陷型酵母因線粒體基因部分缺失不能產(chǎn)生還原氫，不能還原TTC生成紅色的TF，所以菌落呈白色。實驗結(jié)果表明，Y518經(jīng) TTC(圖5A)染色為白色，而2－10515經(jīng)TTC染色為紅色。

圖5 Y518和2－10515的TTC檢測(A)和對非發(fā)酵型物質(zhì)醋酸鈉(B)的反應(yīng)Fig.5 TTC staining(A)and reaction on the non－fermented material acetic acid sodium(B)of Y518 and 2－10515

為做進(jìn)一步確定，根據(jù)呼吸缺陷型酵母不能氧化非發(fā)酵性物質(zhì)，如甘油、醋酸等的原理［2］。將活化的菌種在醋酸鈉培養(yǎng)基上涂布，觀察其生長情況。結(jié)果表明突變菌株Y518在醋酸鈉(圖5B)為碳源的培養(yǎng)基上不能生長，而原始菌株2－10515在醋酸鈉培養(yǎng)基上生長良好。

2.4 Y518與2－10515的菌體蛋白含量比較

從蛋白水平來看，突變菌株Y518和原始菌株2－10515的蛋白表達(dá)有著明顯的差異。Y518的菌體蛋白表達(dá)量始終高于2－10515。Y518蛋白的高表達(dá)可能是與原始菌株2－10515相比Y518對環(huán)境變化更敏感，再加上發(fā)酵的過程中產(chǎn)生的各種脅迫，其通過提高相應(yīng)的應(yīng)激蛋白的表達(dá)和分泌以保證菌體的生存。

圖6 Y518和2－10515的菌體蛋白表達(dá)量Fig.6 Changes of cell total protein of Y518 and 2－10515

2.5 Y518和2－10515乙醇和甘油產(chǎn)量分析

同樣條件下培養(yǎng)Y518和2－10515，不同時間點取樣檢測發(fā)酵液中乙醇和甘油含量。從圖7中可以看出在發(fā)酵初期原始菌株2－10515的乙醇產(chǎn)量高于突變株Y518。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，Y518和2－10515的乙醇產(chǎn)量越來越接近，分別為69.91g/L和72.56g/L。從圖8中可以看出，在發(fā)酵的過程中 Y518和2－10515的甘油產(chǎn)量逐漸降低，而且Y518產(chǎn)生的甘油的量低于2－10515。甘油不僅可以保護(hù)酵母高滲脅迫的作用，還能在厭氧或微氧條件調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞胞內(nèi)氧化還原電勢平衡的重要途徑之一［13］。對比甘油和生長量、葡糖糖消耗以及菌體蛋白的發(fā)酵規(guī)律可以推測，由于甘油的保護(hù)作用，2－10515生長迅速，代謝正常，而Y518的甘油產(chǎn)量低，故生長緩慢，代謝發(fā)生了改變。

圖7 發(fā)酵過程中Y518和2－10515的酒精產(chǎn)量比較Fig.7 Ethanol production of Y518 and 2－10515 in the process of fermentation

3 結(jié)論

圖8 發(fā)酵過程中Y518和2－10515的甘油產(chǎn)量比較Fig.8 Glycerol production of Y518 and 2－10515 at different fermentation time

本實驗對經(jīng)亞硝基胍誘變得到的酵母突變株Y518進(jìn)行了初步的生理生化研究，發(fā)現(xiàn)與原始菌株2－10515相比，Y518在生理和代謝上發(fā)生了顯著變化，而且其呼吸存在缺陷。這些數(shù)據(jù)不僅為接下來的代謝和轉(zhuǎn)錄組等方面研究提供實驗依據(jù)，也為以后的發(fā)酵條件改進(jìn)提供指導(dǎo)。

［1］陳葉福，李軍俠，沈世超，等.釀酒酵母谷胱甘肽產(chǎn)量與鎘鹽抗性關(guān)系的研究與應(yīng)用［J］.中國釀造，2012，31(4):40－43.

［2］鮑曉明，高東.酵母菌呼吸缺陷型的選育［J］.華中農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1984，3(2):44－47.

［3］王莉，陽蕾.啤酒酵母呼吸缺陷型菌株的檢測［J］.啤酒科技，2002，2:10－12.

［4］Viktor K，Margita O，Jitka U，et al.Induction of respirationdeficient mutants in Saccharomyces cerevisiae by chelerythrine［J］.FEMS Microbiology Letters，1994，120:87－92.

［5］王繼花，薛永常，高圣，等.高滲脅迫下啤酒酵母的生理特性研究［J］.中國釀造，2008，5:45－47.

［6］王雅楠，梅艷珍，鄭麗雪，等.酵母突變株Y518谷胱甘肽合成酶結(jié)構(gòu)分析［J］.食品科學(xué)，2009，30(17):258－261.

［7］江潔，卜紅宇.釀酒酵母菌產(chǎn)谷胱甘肽的發(fā)酵條件研究［J］.中國釀造，2009，(1):59－61.

［8］吳小映，李慧萍，何春燕，等.呼吸缺陷型酵母發(fā)酵性能研究［J］.啤酒科技，2007，4:18－21.

［9］趙炯，中藥抗真菌活性測定和酵母利用非發(fā)酵碳源基因的篩選［D］.天津:天津大學(xué)，2007.

［10］舒馨，劉雄民，梁秋霞，等.3，5－二硝基水楊酸吸光光度法測定八角殘渣中總糖，還原糖含量［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(6):341－343.

［11］Alois H，Robert W，Arek N，et al.Comparison of yeast cell protein solubilization procedures fortwo－dimensional electrophoresis［J］.Electrophoresis 1999，(20):826－829.

［12］袁文杰，孔亮，孜力汗，等.高效液相色譜法測定克魯維酵母菊芋發(fā)酵液中的乙醇，糖和有機酸類代謝成分［J］.分析化學(xué)，2009，37(6):850－854.

［13］陳獻(xiàn)忠，王正祥，諸葛健.酵母細(xì)胞甘油代謝與生理功能研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2010，30(5):140－148.